肖曉 周雅思 彭楚茵 鄧金清 王來友 朱文博

中圖分類號 R965 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）23-2827-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.23.03

摘 要 目的：研究溶瘤病毒M1（簡稱“M1病毒”）誘導宮頸癌細胞C-33A凋亡的作用及機制。方法：采用MTT法檢測不同滴度（0、0.001、0.01、0.1、1、10 PFU/cell）M1病毒處理后C-33A細胞的存活率;將C-33A細胞分為對照組（0 PFU/cell）和M1病毒低、中、高劑量組（0.001、0.01、0.1 PFU/cell），加入相應滴度病毒，培養(yǎng)48 h 后，采用流式細胞儀檢測細胞的凋亡率和感染率，采用Western blot法檢測細胞中C/EBP 同源蛋白（CHOP）、胱天蛋白酶12（caspase-12）、caspase-3、活化的caspase-3（cleaved-caspase-3）的表達水平。結果：經(jīng)不同滴度M1病毒處理后，C-33A細胞存活率均顯著降低（P<0.01），且呈劑量依賴趨勢。與對照組比較，M1病毒各劑量組細胞的凋亡率和感染率以及中、高劑量組細胞中CHOP、caspase-12、cleaved- caspase-3（中劑量組除外）蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.01）。結論：M1病毒可誘導宮頸癌細胞C-33A的凋亡，其作用機制可能與激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通路有關。

關鍵詞 溶瘤病毒M1;宮頸癌;C-33A細胞;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激;細胞凋亡

Effects and Mechanism of Oncolytic Virus M1 Inducing the Apoptosis of Cervical Cancer C-33A Cells

XIAO Xiao1，ZHOU Yasi2，PENG Chuyin1，DENG Jinqing2，WANG Laiyou1，ZHU Wenbo3（1. Dept. of Pharmacy， Guangdong Provincial People’s Hospital/Guangdong Academy of Medical Sciences， Guangzhou 510080， China; 2. School of Pharmacy， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China; 3. Dept. of Pharmacology， Zhongshan School of Medicine， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510080， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects and mechanism of oncolytic virus M1 （called M1 virus for short） inducing the apoptosis of cervical cancer C-33A cells. METHODS： MTT assay was used to detect survival rate of C-33A cells that were treated with different titers （0， 0.001， 0.01， 0.1， 1， 10 PFU/cell） of M1 virus. C-33A cells were divided into control group （0 PFU/cell）， low-dose， medium-dose and high-dose groups of M1 virus （0.001， 0.01， 0.1 PFU/cell）. After treated with corresponding titers of M1 virus for 48 h， flow cytometry was used to detect the apoptotic rate and infection rate of cells; Western blot was performed to detect the protein expression of C/EBP homologous proteins （CHOP）， caspase-12， caspase-3 and cleaved-caspase-3. RESULTS： After treated with different titers of M1 virus， the survival rate of C-33A cells decreased significantly （P<0.01）， and showed a dose-dependent trend. Compared with control group， the apoptotic rate and infection rate of cells in M1 virus groups as well as the protein expression of CHOP， caspase-12 and cleaved-caspase-3 （except for medium-dose group） in M1 virus medium-dose and high-dose groups were increased significantly （P<0.01）. CONCLUSIONS： M1 virus can induce the apoptosis of cervical cancer C-33A cells， and its mechanism may be related to the activation of endoplasmic reticulum stress pathway.

KEYWORDS? ?Oncolytic virus M1; Cervical cancer; C-33A cells; Endoplasmic reticulum stress; Cell apoptosis

宮頸癌是常見的女性惡性腫瘤，也是威脅人類生命安全的主要疾病?！?020年全球癌癥報告》顯示：宮頸癌發(fā)病率在女性癌癥中排名第2位，發(fā)病年齡呈年輕化趨勢;2020年全球?qū)m頸癌新發(fā)病例超過60萬例，死亡病例超過34萬[1]。目前，早期宮頸癌的治療效果較好，但晚期宮頸癌患者生存質(zhì)量低、病死率居高不下[2-3]。因此，晚期宮頸癌的治療已經(jīng)成為臨床工作的難點和重點，亟須新的安全有效的臨床方案、策略或者藥物來治療。

溶瘤病毒是一類天然的或經(jīng)過基因修飾的病毒，可特異性地在腫瘤細胞中復制，然后通過直接裂解細胞或者激活免疫來殺傷腫瘤細胞，而不損傷正常細胞[4-5]。近年來溶瘤病毒療法發(fā)展迅速，20余種病毒正在或者已經(jīng)完成臨床研究，且均表現(xiàn)出良好的安全性[4，6];現(xiàn)已被中國以及多個歐美國家批準上市，主要用于治療鼻咽癌、晚期黑色素瘤[7]。相關研究報道證實，單純皰疹病毒、新城疫病毒可殺傷宮頸癌細胞[8-9]。由此可知，溶瘤病毒為抗宮頸癌藥物研發(fā)提供了新的方向。

溶瘤病毒M1（以下簡稱“M1病毒”）屬于披膜病毒科甲病毒屬蓋塔樣病毒，是研究者于1964年從庫蚊屬蚊蟲中分離得到的病毒[10]。甲病毒作為載體已在病毒性疾病的腫瘤疫苗、核酸疫苗、基因治療等方面得到了大量應用[11]，這提示M1病毒有成為新型抗腫瘤藥物的潛力。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、折疊的重要“車間”，當細胞受到過度刺激時，大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)堆積于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激;當劇烈的、長時程的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激不能得到緩解時，就會引起細胞凋亡[12]。M1病毒是否可通過作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)誘導宮頸癌細凋亡，尚不明確?；诖耍狙芯繑M基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通路，研究M1病毒對宮頸癌細胞凋亡的誘導作用及機制，以期為治療晚期宮頸癌的新型藥物開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：CytoFLEX型流式細胞儀（美國Beckman Coulter 公司），Synergy H1型多功能微孔板檢測儀（美國BioTek公司），MicroCL 21型臺式低溫高速離心機、Forma 310 型CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司），TE-2000型倒置相差熒光顯微鏡（日本Nikon公司），ChemiDoc XRS+ System型凝膠成像儀、Mini-PROTEAN Tetra型電泳轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 主要藥品與試劑

MTT試劑（批號T100896）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;細胞凋亡檢測試劑盒（批號FXP023-050）購自北京四正柏生物科技有限公司;ECL發(fā)光液（批號WBKLS0100）購自美國Millipore公司;胎牛血清（批號B21001）購自中山康天晟合生物技術有限公司;胰酶、青鏈霉素、DMEM培養(yǎng)基、VP-SFM培養(yǎng)基（批號分別為25300062、15070063、11965118、11681020）均購自美國Gibco公司;牛血清白蛋白（BSA，批號021998625）購自廣州威佳科技有限公司;鼠源C/EBP 同源蛋白（CHOP）單克隆抗體（批號2895S）、兔源胱天蛋白酶12（caspase-12）多克隆抗體（批號35965）、兔源β-微管蛋白（β-tubulin）單克隆抗體（批號2128S）、兔源caspase-3多克隆抗體（批號9662）、兔源活化的caspase-3（cleaved-caspase-3）單克隆抗體（批號9664）、辣根過氧化物酶（HRP）標記的馬抗鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號7076S）、HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（批號7074S）均購自美國Cell Signaling Technology公司;其余試劑為實驗室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 細胞

本研究所用人宮頸癌細胞C-33A購自中國科學院上海生科院細胞資源中心，非洲綠猴腎細胞Vero、倉鼠腎成纖維細胞BHK-21購自美國ATCC細胞庫。

1.4 病毒

本研究所用M1病毒來源于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

2 方法

2.1 細胞的復蘇、培養(yǎng)及傳代

將細胞凍存管從液氮罐中移出，置于37 ℃水浴條件下快速融化，移出凍存液于離心管中;加入DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青鏈霉素），以1 200 r/min離心5 min，棄上清液;以DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，再移入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（以下培養(yǎng)條件相同）。當細胞融合度達80%～90%時，以胰酶消化傳代，然后取對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

2.2 M1病毒的擴增培養(yǎng)

采用非洲綠猴腎細胞Vero來擴增M1病毒。將Vero細胞接種于100 mm的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至融合度達90%;然后將培養(yǎng)基更換為VP-SFM培養(yǎng)基，加入M1病毒母液（1×107 PFU/mL）20 μL，待80%Vero細胞裂解后（培養(yǎng)48～60 h后），以? ?1 200 r/min離心5 min，取上清液混勻分裝后，于-80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 C-33A細胞存活率的檢測

采用MTT法進行檢測。取對數(shù)生長期的C-33A細胞適量，經(jīng)胰酶消化后，將密度調(diào)整為3×104 mL-1，按100 μL/孔接種于96孔板，培養(yǎng)過夜;然后加入不同滴度[0（作為對照組）、0.001、0.01、0.1、1、10 PFU/cell，滴度參考文獻[13]設置]的M1病毒進行干預，另設不加細胞、不加病毒的空白組，每組設4個復孔。各組細胞培養(yǎng)48 h后，加入MTT試劑（5 mg/mL）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h;棄去上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）100 μL，然后采用多功能微孔板檢測儀于570 nm波長處檢測各孔吸光度（OD），并計算細胞存活率[細胞存活率=（OD給藥組-OD空白組）/ OD對照組×100%]。以GraphPad Prism 8軟件計算M1病毒的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.4 C-33A細胞凋亡率以及病毒感染率的檢測

采用流式細胞儀進行檢測。取對數(shù)生長期的C-33A細胞適量，經(jīng)胰酶消化后，將密度調(diào)整為5×104 mL-1，按2 mL/孔接種于12孔板;培養(yǎng)24 h后，將細胞分為對照組（0 PFU/cell）和M1病毒低、中、高劑量組（0.001、0.01、0.1 PFU/cell，滴度根據(jù)“2.3”項下結果設置），每組設4個復孔。對照組加入VP-SFM培養(yǎng)基，M1病毒各劑量組加入相應滴度病毒。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，按細胞凋亡檢測試劑盒說明書方法操作，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率;同時通過M1病毒自帶的GFP標簽，檢測其對C-33A細胞的感染率。

2.5 C-33A細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通路相關蛋白及凋亡相關蛋白表達水平的檢測

采用Western blot法進行檢測。取對數(shù)生長期的C-33A細胞適量，經(jīng)胰酶消化后，將密度調(diào)整為3×105 mL-1，按3 mL/孔接種于6孔板;培養(yǎng)24 h后，按“2.4”項下方法分組與給藥，每組設4個復孔。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細胞并進行裂解，以獲取蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度后，煮沸5 min使其變性;取變性后蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，以5%的BSA封閉;加入CHOP、caspase-12、cleaved- caspase-3、caspase-3、β-tubulin一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），于4 ℃孵育過夜;以TBST緩沖液洗膜3次、每次5 min，然后加入相應二抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），于室溫孵育1 h;經(jīng)ECL化學發(fā)光試劑顯色后，置于凝膠成像儀上成像。采用Image Lab 4.0軟件進行分析，以目的蛋白與內(nèi)參β-tubulin蛋白的灰度值比值表示目的蛋白的表達水平。

2.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計。數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 M1病毒對C-33A細胞存活率的影響

與對照組比較，M1病毒處理組細胞存活率均顯著降低（P<0.01），且呈劑量依賴趨勢;M1病毒對C-33A細胞的IC50為（0.015 6±0.002 4） PFU/cell。結果見表1。另外，當M1病毒滴度大于1 PFU/cell時，其對細胞存活率的影響趨于穩(wěn)定，故選擇0.001、0.01、0.1 PFU/cell的滴度進行后續(xù)實驗。

3.2 M1病毒對C-33A細胞凋亡率及病毒感染率的影響

與對照組比較，M1病毒低、中、高劑量組細胞凋亡率及感染率均顯著升高（P<0.01）。結果見表2、圖1、圖2。

3.3 M1病毒對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通路相關蛋白及凋亡相關蛋白表達的影響

與對照組比較，M1病毒中、高劑量組細胞中CHOP、caspase-12、cleaved-caspase-3（中劑量組除外）蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.01）。結果見表3、圖3。

4 討論

目前宮頸癌的治療方法主要包括放療、化療、靶向治療、生物治療等。其中，放化療是治療晚期宮頸癌的重要方式，但毒副作用大;靶向治療是藥物進入體內(nèi)后與特定的致癌位點相結合后發(fā)揮抗腫瘤作用;生物治療是通過機體的防御機制，應用生物大分子或小分子化合物調(diào)節(jié)機體生物反應，發(fā)揮抗腫瘤作用[14]。其中，靶向治療和生物治療的安全性高，目前已成為治療腫瘤的有效手段。

本課題組前期研究證實，M1病毒可殺傷膠質(zhì)瘤、黑色素瘤等多種腫瘤細胞[13，15]。將M1病毒注射在大鼠、小鼠、石蟹猴等多種模型動物體內(nèi)后，該病毒可在正常組織中迅速消退，而在腫瘤組織中富集擴增;且受試動物精神狀態(tài)良好，無明顯的體質(zhì)量減輕或者食欲減退的現(xiàn)象[10，13，16]。此外，本課題組也開發(fā)了M1病毒的脂質(zhì)體制劑，結果發(fā)現(xiàn)，該制劑可減少中和抗體的生成，從而發(fā)揮更好的治療效果[17]。由此可知，M1病毒具備良好的臨床應用潛力?；诖?，本研究擬進一步探討M1病毒誘導宮頸癌細胞凋亡的作用及機制。

本研究通過MTT實驗發(fā)現(xiàn)，M1病毒可顯著降低C-33A細胞的存活率且呈劑量依賴趨勢;進一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)M1病毒作用后，細胞凋亡率及感染率均顯著升高。這提示M1病毒感染可能具有促宮頸癌細胞凋亡的作用。

大量外源性病毒累積于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應，進一步激活下游的凋亡通路[12]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的細胞凋亡途徑主要有3條：第一條是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的轉(zhuǎn)錄因子CHOP介導的;第二條是通過c-Jun氨基末端激酶（JNK）通路介導的;第三條是通過凋亡相關的關鍵分子caspase-12介導的[18]。本研究結果顯示，經(jīng)M1病毒作用后，C-33A細胞中CHOP、caspase-12、cleaved- caspase-3（中劑量組除外）蛋白的表達水平均顯著升高。這提示M1病毒可通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通路，促進C-33A細胞凋亡。

綜上所述，M1病毒可誘導宮頸癌細胞C-33A凋亡，其作用機制可能與激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通路有關。本課題組將進一步在體內(nèi)模型上驗證上述結論，以期為臨床應用M1病毒治療晚期宮頸癌提供理論依據(jù)。

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（收稿日期：2021-06-24 修回日期：2021-10-02）

（編輯：唐曉蓮）