羅春雨，李亞飛，劉 奇

（大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

腸道菌群與體脂沉積和肥胖的發(fā)生有著密切的聯(lián)系〔1〕，腸道菌群影響著人體的營養(yǎng)吸收、免疫功能及代謝作用〔2-3〕。陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）屬于腸桿菌科腸桿菌屬，為革蘭氏陰性粗短桿菌，是腸道正常菌種之一，也是重要的條件致病菌。趙立平等〔4〕在對腸道菌群的研究中發(fā)現(xiàn)，患者肥胖與腸道的陰溝腸桿菌有直接聯(lián)系。伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基可以初步分離革蘭氏陰性腸道致病菌，在該選擇培養(yǎng)基上，大腸埃希菌呈現(xiàn)紫黑色金屬光澤菌落，產(chǎn)氣腸桿菌呈棕色的大菌落，沙門氏菌等為無色或琥珀色半透明菌落，陰溝腸桿菌為粉色大菌落，因此使用該選擇性培養(yǎng)基可對腸道桿菌作初步篩選。本研究采用Spearman 秩相關(guān)系數(shù)法，分析陰溝腸桿菌在腸桿菌科中的菌落數(shù)比例與在校學(xué)生體質(zhì)指數(shù)（body mass index，BMI）的相關(guān)性，從而對陰溝腸桿菌與在校大學(xué)生肥胖的關(guān)系進(jìn)行探究〔5〕，進(jìn)一步為個體化的科學(xué)減肥方法提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 大理大學(xué)在校42 名健康大學(xué)生新鮮糞便0.5～3.0 g；陰溝腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 700323，由大理大學(xué)病原生物學(xué)綜合實驗室提供，于－80 ℃冰箱保存。

1.1.2 試劑 伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）；10×PCR Mix、100 bp DNA Marker（南京賽泓瑞生物科技有限公司）；Tris 飽和酚（宜興市廣匯助劑化工有限公司）；氯仿、異戊醇（上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司）；引物由蘇州金智唯生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)檢測 將所得糞便標(biāo)本分別進(jìn)行涂片、革蘭氏染色，顯微鏡下觀察。

1.2.2 標(biāo)本的稀釋和培養(yǎng) 用無菌0.9%氯化鈉溶液以10 倍稀釋法稀釋0.1 g 新鮮糞便。用無菌棉簽將稀釋后的標(biāo)本均勻涂布于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h。確定最佳稀釋梯度為10－3～10－4g/mL。再將該稀釋濃度的糞便樣品涂布于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，每份樣品重復(fù)3 次，37 ℃培養(yǎng)24 h。記錄疑似陰溝腸桿菌的粉色菌落數(shù)，并計算菌落的比例。

1.2.3 菌種PCR 鑒定 參考文獻(xiàn)〔6-7〕，合成陰溝腸桿菌特異性引物，正向引物：5′-CATGACACCGGT GTTTCCCCAGT-3′；反向引物：5′-CGGTCGGTGAAG CCCAGAACCACTA-3′。選取疑似陰溝腸桿菌進(jìn)行菌落PCR 鑒定，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的體積為20 μL。用2% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照〔8〕。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料用（±s）表示。用Spearman秩相關(guān)進(jìn)行結(jié)果的相關(guān)性分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糞便涂片革蘭氏染色結(jié)果 將42 份糞便標(biāo)本進(jìn)行涂片染色，顯微鏡下觀察。每份均按照革蘭氏陽性（G+）桿菌、革蘭氏陽性（G+）球菌、革蘭氏陰性（G-）桿菌、革蘭氏陰性（G-）球菌分類依次計數(shù)，并計算所占比例。4 種菌落所占的比例分別為：（30.0±11.7）% ，（20.0 ±13.3）% ，（32.3 ±15.1）% ，（17.6 ±8.7）%。涂片結(jié)果顯示陰溝腸桿菌所屬的G-桿菌比例最高。

2.2 陰溝腸桿菌培養(yǎng)結(jié)果 將糞便標(biāo)本以10-3、10-4g/mL 兩個稀釋濃度均勻涂布在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，分類和計數(shù)全部菌落。統(tǒng)計粉色菌落的疑似陰溝腸桿菌菌落數(shù)及所占比例。結(jié)果顯示，陰溝腸桿菌所占比例為（25.7±23.5）%。其中，男性（35.3±24.3）%，女性（16.1±18.7）%，男性陰溝腸桿菌比例大于女性（P=0.007）。

2.3 陰溝腸桿菌菌落PCR 鑒定結(jié)果 參考文獻(xiàn)〔7〕，特異性引物擴(kuò)增的385 bp 大小的特異性條帶為陰溝腸桿菌部分基因序列。菌落PCR 鑒定結(jié)果中，1號和21 號泳道為陰溝腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株，385 bp附近可見清晰條帶。見圖1。擴(kuò)增序列中有13 份PCR 陽性的菌株在標(biāo)準(zhǔn)條帶300～400 bp 之間，與標(biāo)準(zhǔn)菌株的條帶位置一致。由此確證，伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基中的粉紅色菌落為陰溝腸桿菌。

圖1 陰溝腸桿菌菌落PCR 鑒定結(jié)果圖

2.4 大學(xué)生BMI 分布 目前國際上常用的衡量人體胖瘦程度的標(biāo)準(zhǔn)為BMI〔9〕。BMI＜18.5 kg/m2為體質(zhì)量過低；18.5 kg/m2≤BMI＜24.0 kg/m2為體質(zhì)量正常；24.0 kg/m2≤BMI＜28.0 kg/m2為體質(zhì)量超重；BMI≥28.0 kg/m2為肥胖。統(tǒng)計42 名大學(xué)生的BMI，其平均值為（22.2±3.8）kg/m2，具體分布情況見表1。

表1 大學(xué)生BMI 分布表（n=42）

2.5 不同BMI 組的陰溝腸桿菌菌落比例比較 進(jìn)一步統(tǒng)計分析不同BMI 組陰溝腸桿菌的菌落比例。見圖2。其中，過低組陰溝腸桿菌菌落比例為（6.3±4.2）%，正常組為（20.9±18.3）%，超重組為（34.0±24.5）%，肥胖組為（64.0±32.2）%。由圖2 可見，4 個組中BMI 值越高，陰溝腸桿菌菌落比例也越高。但經(jīng)卡方檢驗Fisher′s 確切概率法得P=0.277＞0.05，即各組間陰溝腸桿菌菌落比例的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，推測此結(jié)果與樣本量偏低有關(guān)。

圖2 不同BMI 組陰溝腸桿菌比例分布圖

2.6 BMI 與陰溝腸桿菌菌落比例的相關(guān)性分析陰溝腸桿菌菌落比例與體質(zhì)量之間呈正相關(guān)。見圖3。將兩者進(jìn)行相關(guān)性分析，得到Spearman 秩相關(guān)系數(shù)rs= 0.529 ＞0.5（P＜0.001）。由結(jié)果可知BMI 與陰溝腸桿菌菌落比例之間呈正相關(guān)，且相關(guān)具有顯著性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 陰溝腸桿菌菌落比例與BMI 的相關(guān)性

3 討論

肥胖是以脂肪代謝失衡為表現(xiàn)特征的一種營養(yǎng)性代謝紊亂疾病，已嚴(yán)重影響人類健康。腸道菌群可促進(jìn)與脂肪合成相關(guān)的基因表達(dá)，并使肝臟脂肪細(xì)胞積累甘油三酯。此外，人體腸道內(nèi)存在相對復(fù)雜的微生物群體，微生物群體不同，代謝效率也不同。不同的微生物組成會促進(jìn)脂肪的能量儲存，或阻礙脂肪的消耗，從而導(dǎo)致肥胖。腸道內(nèi)復(fù)雜的微生物菌群與人體的機(jī)體環(huán)境，以及外界環(huán)境的相互作用，會影響機(jī)體的營養(yǎng)、免疫和代謝〔10〕。腸道內(nèi)壁上的保護(hù)屏障可抑制致病病原菌的入侵以及生長，它是由腸道菌群附著形成的，從而發(fā)揮對機(jī)體的保護(hù)功能〔11〕。

進(jìn)入21 世紀(jì)，隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，全國大學(xué)生的肥胖問題，已成為影響中國大學(xué)生身心健康的最重要因素之一〔12〕。2013年，美國醫(yī)學(xué)會就肥胖是一種疾病進(jìn)行了正式的宣告〔13〕，世界衛(wèi)生組織稱，截至2016年，全球肥胖人口超過6.5 億，預(yù)計到2030年全球肥胖患者將達(dá)到11.2 億〔14〕，肥胖患者人數(shù)在中國也在不斷增加。研究表明，肥胖對學(xué)生的血糖、心肺系統(tǒng)和心理健康有不同程度的影響，肥胖在未來的發(fā)展中會繼續(xù)影響兒童的健康〔15〕。如何預(yù)防肥胖流行已成為21 世紀(jì)上半葉全球面臨的最重大的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)。

近年來，對影響人類肥胖的大量研究表明，環(huán)境因素具有重要的作用，其中尤為重要的是人類腸道系統(tǒng)中的共生微生物〔16-17〕。劉洋〔18〕發(fā)現(xiàn)人體的腸道菌群與體脂沉積、肥胖的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系；趙立平在臨床研究中發(fā)現(xiàn)一位肥胖患者腸道陰溝腸桿菌過度增長，而在該患者體質(zhì)量恢復(fù)正常后，陰溝腸桿菌數(shù)量降至檢測不到的水平〔4〕。這是首個關(guān)于腸道細(xì)菌引起肥胖癥的最直接的證據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，體質(zhì)量過低組、正常組、過高組和肥胖組的糞便標(biāo)本中，陰溝腸桿菌的菌落比例依次增加。此外，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，大學(xué)生陰溝腸桿菌菌落比例與其BMI 呈現(xiàn)顯著正相關(guān)。這在另一個側(cè)面，佐證了陰溝腸桿菌可能是影響肥胖的重要因素之一。然而，腸道陰溝腸桿菌如何影響B(tài)MI 等一系列問題，還需要進(jìn)一步的研究。