張帥 王江紅 田利杰 王寶利 張娟

1.天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科，天津300070；2.天津醫(yī)科大學(xué)朱憲彝紀(jì)念醫(yī)院·內(nèi)分泌研究所，天津300134

顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)?。╰emporomandibular joint osteoarthritis，TMJOA） 作為一種退行性關(guān)節(jié)疾病，其特征是軟骨成分的退變以及軟骨下骨的異常改建[1]。TMJOA 的發(fā)病人群主要集中于女性，影像學(xué)表現(xiàn)為髁突表面磨損變平或變尖、骨贅形成、囊樣變等，髁突表面軟骨細(xì)胞死亡，軟骨基質(zhì)降解是造成TMJOA的重要原因之一[2-3]。

由于女性易患TMJOA，雌激素在TMJOA 發(fā)生發(fā)展過程中的作用引起關(guān)注。在自然TMJOA 模型中，17β-雌二醇（17β-estradiol，E2） 的應(yīng)用能有效緩解關(guān)節(jié)軟骨退變，表明E2 對關(guān)節(jié)軟骨存在保護(hù)作用，然而該保護(hù)作用機(jī)制尚未明確[4-5]。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR） 廣泛存在于各種細(xì)胞中，在細(xì)胞自噬活動中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。mTOR 通過磷酸化能夠活化并能有效抑制自噬關(guān)鍵標(biāo)志物脂質(zhì)化輕鏈蛋白3B （lipid modified of light chain 3B，LC3-Ⅱ） 的形成，從而抑制細(xì)胞自噬。近期研究[6]表明，mTOR 信號在細(xì)胞生長增殖過程中也起到重要作用。

雷帕霉素（rapamycin，RAPA） 是一種自噬誘導(dǎo)劑，也是特異性mTOR抑制劑，可以抑制mTOR的磷酸化。研究[7]表明，顳下頜關(guān)節(jié)損傷模型中的軟骨退變會伴有軟骨內(nèi)自噬水平的降低，而RAPA的應(yīng)用可以特異性提高軟骨內(nèi)自噬水平，提高軟骨細(xì)胞抗損傷能力并延緩關(guān)節(jié)軟骨的退變進(jìn)程。

本實(shí)驗(yàn)通過檢測E2 在不同條件下對髁突軟骨細(xì)胞增殖及自噬相關(guān)指標(biāo)的影響，來探討E2 影響髁突軟骨細(xì)胞增殖能力的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

6 周齡雌性SD 大鼠20 只（北京斯貝福公司），動物使用符合我國關(guān)于動物保護(hù)管理委員會相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑

總RNA 快速提取試劑盒（Omega 公司，美國），高效率逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo公司，美國），SP-9000 試劑盒（上海生工生物工程有限公司），無酚紅培養(yǎng)基（天津可典生物科技有限公司），雌激素受體α （estrogen receptor alpha，ERα） 單克隆抗體（Abcam 公司，英國），β-actin 單克隆抗體、雌激素受體β （estrogen receptor beta，ERβ） 單克隆抗體、LC3-Ⅱ單克隆抗體（Proteintech公司，美國），E2、RAPA、ERβ 拮抗劑PHTPP、ERα 拮抗劑AZD9496 （MCE 公司，美國），磷酸化雷帕霉素哺乳動物靶標(biāo)（phosphorylate-mammalian target of rapamycin，p-mTOR） 單克隆抗體（CST 公司，美國）。

1.3 方法

1.3.1 大鼠髁突軟骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 取大鼠髁突軟骨，剪碎后于15 mL離心管中以0.25% 胰酶消化30 min，終止消化后離心棄去上清液，以0.2%Ⅱ型膠原酶消化5 h 后，接種到含20% 胎牛血清和1% 雙抗的無酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基中，于37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d 進(jìn)行換液。后續(xù)實(shí)驗(yàn)以含10% 胎牛血清和1% 雙抗的無酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞傳代使用胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，DMEM 終止消化并接種于培養(yǎng)皿中，次日換液。

1.3.2 軟骨細(xì)胞的觀察和鑒定 運(yùn)用倒置顯微鏡觀察并分析各代髁突軟骨細(xì)胞形態(tài)、胞間連接及胞膜表面是否出現(xiàn)細(xì)胞突起。取第3代細(xì)胞進(jìn)行Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色，取6孔板圓形空白細(xì)胞爬片置于100 mm 培養(yǎng)皿中，設(shè)置3 個重復(fù)板，滴加細(xì)胞懸液并沒過爬片，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后，以4% 多聚甲醛固定20 min，PBS沖洗后于0.5% TritonX-100中室溫孵育20 min，按照SP-9000試劑盒說明進(jìn)行染色，并孵育Ⅱ型膠原一抗稀釋液，于4 ℃環(huán)境下過夜，次日依次加入生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG及辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液孵育，使用DAB/AEC 顯色液，室溫孵育5～8 min 后行復(fù)染，梯度乙醇脫水封片，顯微鏡下觀察，判讀，觀察細(xì)胞胞漿染色變化，深染為陽性改變，如無深染則為陰性改變，對照組細(xì)胞使用成纖維細(xì)胞。

1.3.3 髁突軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)分組 第一部分實(shí)驗(yàn)：E2 對髁突軟骨細(xì)胞增殖及自噬的影響。將第二代髁突軟骨細(xì)胞分為4組：空白對照組（培養(yǎng)基中僅含等濃度DMSO）、10-6mol·L-1E2 組（實(shí)驗(yàn)組1）、10-8mol·L-1E2 組（實(shí)驗(yàn)組2）、10-10mol·L-1E2 組（實(shí)驗(yàn)組3）。

第二部分實(shí)驗(yàn)：E2 及RAPA 共同作用對髁突軟骨細(xì)胞增殖及自噬的影響。將第二代髁突軟骨細(xì)胞分為8組：空白對照組（培養(yǎng)基中僅含等濃度DMSO）、10-6mol·L-1E2組（實(shí)驗(yàn)組1）、10-8mol·L-1E2 組（實(shí)驗(yàn)組2）、10-10mol·L-1E2 組（實(shí)驗(yàn)組3）、10-9mol·L-1RAPA 組（實(shí)驗(yàn)組4）、10-6mol·L-1E2+10-9mol·L-1RAPA 組（實(shí)驗(yàn)組5）、10-8mol·L-1E2+10-9mol·L-1RAPA組（實(shí)驗(yàn)組6）、10-10mol·L-1E2+10-9mol·L-1RAPA組（實(shí)驗(yàn)組7）。

第三部分實(shí)驗(yàn)：E2、RAPA 及ERα 拮抗劑AZD9496 或ERβ 拮抗劑PHTPP 共同作用對髁突軟骨細(xì)胞p-mTOR表達(dá)的影響。將第二代髁突軟骨細(xì)胞分為6組：空白對照組（培養(yǎng)基中僅含等濃度DMSO）、10-9mol·L-1RAPA組（實(shí)驗(yàn)組1）、10-8mol·L-1E2 組（實(shí)驗(yàn)組2）、10-8mol·L-1E2+10-9mol·L-1RAPA 組（實(shí)驗(yàn)組3）、10-8mol·L-1E2+10-6mol·L-1AZD9496 組（實(shí)驗(yàn)組4）、10-8mol·L-1E2+10-6mol·L-1PHTPP組（實(shí)驗(yàn)組5）。

1.3.4 CCK8 實(shí)驗(yàn) 第一部分實(shí)驗(yàn)和第二部分實(shí)驗(yàn)進(jìn)行CCK8 實(shí)驗(yàn)。取第二代髁突軟骨細(xì)胞以每孔2×103個的密度進(jìn)行鋪板（96 孔板），次日換液給藥，分組按照上述第一部分和第二部分實(shí)驗(yàn)分組執(zhí)行，每組設(shè)置6 個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次；培養(yǎng)時間分為24、48、72 h。于各培養(yǎng)時間點(diǎn)換液后每孔加入10 μL CCK8 溶液，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h；處理結(jié)束后于全波長掃描酶標(biāo)儀（BioTek公司，美國） 在波長450 nm下測定各孔光密度（optical density，OD） 值。

1.3.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR） 檢測髁突軟骨細(xì)胞自噬及增殖相關(guān)基因表達(dá) 第一部分實(shí)驗(yàn)進(jìn)行RT-PCR 實(shí)驗(yàn)。取第二代髁突軟骨細(xì)胞以每孔2×104個的密度進(jìn)行鋪板（24 孔板），次日換液給藥，分組按照上述第一部分實(shí)驗(yàn)分組執(zhí)行，每組設(shè)置3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；培養(yǎng)第48小時收集細(xì)胞?？俁NA 快速提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA；高效率逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行細(xì)胞總RNA 逆轉(zhuǎn)錄；2×SYBN Green qPCR Kit （上海生工生物工程有限公司） 檢測ERα、ERβ、Ⅱ型膠原（collagen type Ⅱ，COLⅡ）、自噬相關(guān)基因6 （autophagy-related gene 6，ATG-6/Beclin-1）、自噬相關(guān)基因5 （autophagyrelated gene 5，ATG-5） 基因表達(dá)水平；以β-actin作為內(nèi)部參照基因，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。本實(shí)驗(yàn)所采用的RT-PCR引物序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.3.6 蛋白印跡（Western blot） 檢測髁突軟骨細(xì)胞自噬及增殖相關(guān)蛋白表達(dá) 各部分實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行Western blot 實(shí)驗(yàn)。取第二代髁突軟骨細(xì)胞以每孔2×105個的密度進(jìn)行鋪板（6 孔板），次日換液給藥，分別按照以上對應(yīng)實(shí)驗(yàn)部分進(jìn)行分組，每組設(shè)置3 個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次；第一部分實(shí)驗(yàn)于培養(yǎng)24、48、72 h 后收集細(xì)胞；第二、三部分實(shí)驗(yàn)于培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。RIPA裂解細(xì)胞提取蛋白；BCA 法測定蛋白濃度；十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE） 法分離蛋白；聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF） 膜轉(zhuǎn)膜；5% 牛奶室溫封閉1 h 后加入一抗液（ERα、ERβ、Beclin-1、LC3-Ⅱ、p-mTOR，1∶1 000 稀釋） 于4 ℃環(huán)境下孵育過夜；次日，TBST 蕩洗5次，隨后加入二抗液（HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG，3∶1 000 稀釋、HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，1∶1 000 稀釋） 室溫孵育2 h；TBST 蕩洗3 次后采用電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL） 液顯影，Image-J分析條帶灰度值，計(jì)算相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，對所測結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。當(dāng)P＜0.05 時認(rèn)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 髁突軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定

接種后，原代細(xì)胞表現(xiàn)為較小的三角形形態(tài)，散在分布；第一代到第三代軟骨細(xì)胞表現(xiàn)為典型“鋪石路” 樣，且生長較快，胞核明顯，狀態(tài)較好；第五代到第七代軟骨細(xì)胞可見成纖維樣細(xì)胞成分開始有所增加，但主體仍為軟骨細(xì)胞，生長狀態(tài)較好；第九代軟骨細(xì)胞中，細(xì)胞形態(tài)全部轉(zhuǎn)化為成纖維型，并有多個突起，增殖能力顯著下降（圖1A）。第三代軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色后，可見軟骨細(xì)胞胞漿呈棕褐色改變，顯示為陽性變化；非軟骨細(xì)胞胞漿無深染，呈陰性變化（圖1B）。

圖1 髁突軟骨細(xì)胞形態(tài)及其Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色Fig 1 The morphology and immunohistochemical staining of type Ⅱcollagen of condylar chondrocytes

2.2 髁突軟骨細(xì)胞在不同濃度E2 作用下的增殖變化

不同E2 濃度下，檢測軟骨細(xì)胞在給藥后24、48、72 h 的增殖水平（圖2）。由圖2 可見，給予E2 后，髁突軟骨細(xì)胞的增殖速度顯著加快，并存在明顯的中間最優(yōu)濃度及雙向性作用，表現(xiàn)為在E2 濃度為10-8mol·L-1時，髁突軟骨細(xì)胞增殖最快（P＜0.05），而低于或高于該濃度會不同程度地降低E2 對髁突軟骨細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。同時各組細(xì)胞數(shù)量均在第48 小時達(dá)到頂峰，在第72 小時達(dá)到平臺期并發(fā)生下降。

圖2 E2對髁突軟骨細(xì)胞增殖的影響Fig 2 The effect of E2 on the proliferation of condylar chondrocytes

2.3 E2 對髁突軟骨細(xì)胞增殖、自噬相關(guān)靶標(biāo)表達(dá)的影響

RT-PCR 結(jié)果顯示在培養(yǎng)第48小時，各組細(xì)胞中ERα 和ColⅡ的基因表達(dá)水平隨E2 濃度的增加而先升高后降低，呈現(xiàn) “倒V 形”，并在濃度為10-8mol·L-1時達(dá)到峰值（P＜0.01），ERβ 的基因水平則無明顯變化。同時，Beclin-1 和ATG-5 的基因水平在低濃度E2處理組（10-10、10-8mol·L-1） 中顯著低于對照組（P＜0.05）（圖3A～E）。

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果與RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨于相同，如圖3F 所示，在培養(yǎng)第48 小時，與空白對照組相比，E2 處理組中p-mTOR 表達(dá)顯著升高，Beclin-1 和LC3-Ⅱ表達(dá)降低，其中p-mTOR 蛋白在10-8mol·L-1E2 組中表達(dá)量最高（P＜0.05）；同時，在10-8mol·L-1E2 組中，ERα 表達(dá)量達(dá)到最高（P＜0.05），ERβ的表達(dá)則沒有明顯變化（P＞0.05）。

10-8mol·L-1E2 組在第24、48、72 小時各蛋白表達(dá)量的表達(dá)結(jié)果見圖3G。在第48 小時，細(xì)胞中p-mTOR 和ERα 的表達(dá)量最高，高于第24、72 小時相應(yīng)蛋白表達(dá)量（P＜0.05）；在第72小時，相較于第24、48小時，細(xì)胞中Beclin-1、LC3-Ⅱ、ERβ的表達(dá)量明顯升高，p-mTOR和ERα的水平顯著下降（P＜0.05）。

圖3 E2對髁突軟骨細(xì)胞增殖、自噬相關(guān)靶標(biāo)表達(dá)的影響Fig 3 The effects of E2 on the expression of targets related to proliferation and autophagy of condylar chondrocytes

2.4 p-mTOR 在E2 促進(jìn)髁突軟骨細(xì)胞增殖中的作用

為驗(yàn)證E2 對髁突軟骨細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用是否涉及p-mTOR，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用mTOR 特異性抑制劑RAPA，結(jié)果見圖4A～C，CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用RAPA 處理髁突軟骨細(xì)胞后，在各培養(yǎng)時間點(diǎn)，細(xì)胞增殖水平均顯著低于單純E2組（P＜0.05）。Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RAPA 能夠抑制對照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中p-mTOR 的表達(dá)，促進(jìn)Beclin-1 和LC3-Ⅱ的表達(dá)（P＜0.01），但對ERα 和ERβ 表達(dá)的影響不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖4D）。

圖4 RAPA對E2促進(jìn)髁突軟骨細(xì)胞增殖的影響Fig 4 The effect of RAPA on the proliferation ability of condylar chondrocytes with different E2 levels

2.5 雌激素受體抑制劑對E2 作用下髁突軟骨細(xì)胞中p-mTOR蛋白表達(dá)的影響

在10-8mol·L-1E2 處理組中， 加入AZD9496后，軟骨細(xì)胞中p-mTOR的表達(dá)明顯降低，接近對照組水平（P＜0.01），而加入PHTPP 后，與單純10-8mol·L-1E2處理組相比，p-mTOR的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖5）。

圖5 雌激素受體抑制劑對各組軟骨細(xì)胞中p-mTOR蛋白表達(dá)的影響Fig 5 The effect of estrogen receptor inhibitors on the p-mTOR expression of chondrocytes

3 討論

TMJOA 是一種發(fā)生于軟骨和軟骨下骨的漸進(jìn)性退行性疾病，軟骨的退變核心在于軟骨細(xì)胞的死亡以及軟骨基質(zhì)的降解破壞。既往研究表明，E2的應(yīng)用能有效緩解關(guān)節(jié)軟骨退變[4-5]，對體外培養(yǎng)的髁突軟骨細(xì)胞起到雙向調(diào)節(jié)作用（低濃度促進(jìn)細(xì)胞增殖，高濃度抑制細(xì)胞增殖），并在10-8mol·L-1濃度下對體外培養(yǎng)的人胚或兔髁突軟骨細(xì)胞具有最顯著的促增殖作用[8]。在本實(shí)驗(yàn)中，10-10、10-8mol·L-1E2 處理后的大鼠髁突軟骨細(xì)胞增殖活力明顯高于對照組，也驗(yàn)證了E2 對髁突軟骨細(xì)胞具有促增殖作用。然而E2 對髁突軟骨細(xì)胞的作用機(jī)制尚未明確。

自噬是一種細(xì)胞內(nèi)部調(diào)節(jié)過程，起到雙向作用。一方面，自噬是一種細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下的適應(yīng)性反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞存活；另一方面，過度自噬會引發(fā)Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，參與疾病的發(fā)生發(fā)展。mTOR 信號分子是細(xì)胞中廣泛存在的調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞自噬及增殖活動中發(fā)揮重要作用[7]。髁突軟骨作為下頜骨生長發(fā)育及負(fù)重中心[9]，其細(xì)胞中mTOR 的作用機(jī)制可能更加復(fù)雜。既往研究[10]表明，mTOR 的磷酸化狀態(tài)受到抑制后，細(xì)胞會激活本體自噬反應(yīng)，并可觀察到細(xì)胞生長速度減緩。因此本研究旨在探討自噬反應(yīng)是否參與了E2對髁突軟骨細(xì)胞增殖活動的調(diào)節(jié)。

以往相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，E2作用于不同細(xì)胞系后，細(xì)胞中的自噬反應(yīng)變化不同[11-12]，有結(jié)果顯示E2可以促進(jìn)人永生化軟骨細(xì)胞系p-mTOR表達(dá)，抑制其自噬活動[11]；而同樣有結(jié)果顯示E2 作用于人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞后會抑制細(xì)胞中p-mTOR表達(dá)，促進(jìn)其自噬活動[12]。本研究中Western blot 結(jié)果顯示，在E2 處理的髁突軟骨細(xì)胞中，p-mTOR 表達(dá)量升高，Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達(dá)量降低，細(xì)胞自噬受到抑制，并且這種變化呈現(xiàn)出劑量依賴性的特點(diǎn)，表現(xiàn)為當(dāng)E2 濃度為10-8mol·L-1時，p-mTOR 升高最明顯，而高于或低于該濃度，p-mTOR的水平都會相對降低，提示E2 對細(xì)胞增殖活動的調(diào)節(jié)中可能涉及p-mTOR分子。

RAPA 是一種特異性mTOR 抑制劑及自噬誘導(dǎo)劑，可特異性抑制mTOR 的磷酸化修飾[13]。本實(shí)驗(yàn)中，RAPA 的應(yīng)用顯著降低了細(xì)胞中p-mTOR 水平，并降低了細(xì)胞增殖活性，這可能是由細(xì)胞自噬活動增強(qiáng)，自身相對穩(wěn)態(tài)增加，同時抑制自身有絲分裂活動所導(dǎo)致的[13]。該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證mTOR 的磷酸化形式在細(xì)胞增殖過程中具有重要作用。而RAPA對關(guān)節(jié)損傷模型中軟骨的保護(hù)作用可能是通過促進(jìn)軟骨細(xì)胞自噬活動，將更多蛋白質(zhì)用以修復(fù)細(xì)胞損傷而實(shí)現(xiàn)的，從而能夠延緩關(guān)節(jié)軟骨退變進(jìn)程。

大量早期實(shí)驗(yàn)均提及到E2 主要通過兩大核受體ERα、ERβ發(fā)揮其生物學(xué)效能，如調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等[14]。在本研究中，ERα在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)隨著E2 處理濃度的升高而變化，并在10-8mol·L-1的濃度下達(dá)到峰值，并與細(xì)胞中p-mTOR水平呈現(xiàn)出明顯正相關(guān)性，此外，p-mTOR和ERα的表達(dá)量變化也呈現(xiàn)出與培養(yǎng)時間相關(guān)的一致性，表現(xiàn)為在第48 小時，p-mTOR 和ERα 蛋白表達(dá)量最高，并與該濃度下，細(xì)胞的增殖變化趨勢一致。表明E2 可能通過ERα 激活mTOR 并發(fā)揮作用。為驗(yàn)證E2 是否通過雌激素受體進(jìn)而調(diào)節(jié)mTOR 的磷酸化修飾，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用了ERα 拮抗劑AZD9496 和ERβ 拮抗劑PHTPP，結(jié)果顯示，當(dāng)應(yīng)用AZD9496 后，細(xì)胞中mTOR 的磷酸化水平明顯降低，并接近對照組水平；而應(yīng)用PHTPP 后，細(xì)胞中p-mTOR 水平未有明顯變化。說明E2 至少可以通過ERα 而非ERβ 改變細(xì)胞中p-mTOR水平并進(jìn)而影響細(xì)胞增殖活力。

以上研究表明，E2 可以通過ERα-p-mTOR 通路抑制細(xì)胞自噬，促進(jìn)細(xì)胞增殖，提示E2-ERα-pmTOR 通路在TMJOA 的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮作用。值得注意的是，本實(shí)驗(yàn)在第一階段（雌激素處理階段），發(fā)現(xiàn)在E2 處理后第48 小時，高濃度E2 （10-6mol·L-1） 條件下，細(xì)胞中自噬相關(guān)標(biāo)志物在基因水平上高于對照組，但在蛋白水平上低于對照組，提示高濃度E2 對髁突軟骨細(xì)胞中自噬的調(diào)節(jié)可能存在時效性及雙向性作用，即初期抑制細(xì)胞自噬，后期促進(jìn)細(xì)胞自噬。并且，Xiang 等[15]研究表明E2 對乳腺癌細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)確實(shí)存在雙向性作用，能夠?qū)⒓?xì)胞中自噬水平維持在一個穩(wěn)定的范圍內(nèi)，而自噬水平的失衡可能會導(dǎo)致細(xì)胞增殖活性的改變；此外，何磊等[12]實(shí)驗(yàn)中用于處理細(xì)胞的E2 濃度遠(yuǎn)超10-6mol·L-1，而結(jié)果顯示該條件下，細(xì)胞的自噬作用增強(qiáng)，這些結(jié)果均說明不同濃度E2 對同種細(xì)胞或不同細(xì)胞的效應(yīng)具有差別，甚至作用相反。因此，關(guān)于高濃度E2 對于髁突軟骨細(xì)胞中p-mTOR及自噬的調(diào)節(jié)機(jī)制和意義尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)闡明在10-8mol·L-1E2 條件下，E2 能通過ERα 途徑促進(jìn)p-mTOR 的表達(dá)，并在體外培養(yǎng)的髁突軟骨細(xì)胞增殖活動中發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用，該研究或可為探究E2 與TMJOA 之間的關(guān)系提供一個新的思考方向，然而鑒于本實(shí)驗(yàn)所采用的E2 濃度的局限性以及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)具有的偏差性，E2 與p-mTOR 和細(xì)胞或組織之間的具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。