朱 宇，張志俊，劉科藍(lán)

0 引 言

百草枯(paraquat, PQ)中毒是最常見的中毒類型之一。由于缺乏有效的特異性解毒藥物，百草枯中毒患者的病死率極高，達(dá)到60%～80%[1]。由于肺部的主動(dòng)攝取機(jī)制，百草枯常積聚于肺并引起肺損傷和肺纖維化。百草枯中毒引起肺組織病變的相關(guān)分子機(jī)制并不明確，主要涉及氧化-抗氧化失衡、脂質(zhì)過氧化、炎癥激活和細(xì)胞凋亡等病理生理過程[2]。近年來，中藥以及中藥相關(guān)活性成分對(duì)肺損傷的保護(hù)作用逐漸受到重視，如血必凈[3]、牛蒡子苷元[4]等。其中枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides, LBP)被認(rèn)為具有抗氧自由基、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用，具備一定的轉(zhuǎn)化應(yīng)用價(jià)值[5]。本研究擬探究枸杞多糖對(duì)百草枯所致大鼠肺損傷的保護(hù)作用并初步探索潛在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑枸杞多糖(Solarbio, 純度≥90%)，百草枯(Sigma公司)，羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)含量測定試劑盒(Solarbio)，髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)測定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量檢測試劑盒、超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)活性測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)檢測ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測ELISA試劑盒(上海碧云天公司)，蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)檢測核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)、β-actin相關(guān)抗體(美國Abcam公司)。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及取材SPF級(jí)雄性SD大鼠24只(8～10周齡，體重200～220 g)由江蘇省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(蘇)2016-0002。飼養(yǎng)于相對(duì)濕度50%～60%、溫度22～24 ℃的環(huán)境中，光照周期12 h，自由飲水和進(jìn)食。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：百草枯組(n=8)：腹腔注射百草枯(20 mg/kg)；PQ+LBP組(n=8)：腹腔注射百草枯(20 mg/kg)后灌胃給予枸杞多糖(400 mg/kg)；對(duì)照組(n=8)：腹腔注射等量等滲鹽水。大鼠于實(shí)驗(yàn)后3 d麻醉處死并留取肺組織標(biāo)本。

1.3 大鼠肺濕/干重比分析和羥脯氨酸含量檢測測定大鼠肺濕/干重比檢測時(shí)，取左肺擦干表面液體，稱取其濕質(zhì)量(W)，將其置于烘箱中晾干至恒重，稱取干質(zhì)量(D)，計(jì)算兩者比值即為濕/干重比(W/D)。按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程檢測檢測肺組織羥脯氨酸含量。

1.4 MPO、MDA和SOD水平檢測按照對(duì)應(yīng)試劑盒說明書要求分別檢測肺組織勻漿中MPO、MDA和 SOD的水平。

1.5 IL-1β、TNF-α表達(dá)水平檢測采用ELISA試劑盒分別檢測3組大鼠肺組織勻漿中炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平。

1.6 Western blot檢測肺組織Nrf2和HO-1表達(dá)水平取大鼠肺組織按每100 毫克加1 mL組織裂解液，充分勻漿后收集上清并測定蛋白濃度。聚丙烯酰氨凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，采用含有5%牛血清白蛋白(BSA)的封閉液封閉后，加入對(duì)應(yīng)一抗，孵育后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，孵育后增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，條帶灰度值采用Image J軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺組織學(xué)改變、濕/干重比和羥脯氨酸含量比較大鼠肺組織切片經(jīng)HE染色后，在光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：百草枯組大鼠在腹腔注射百草枯 3 d后，肺部滲出明顯增多，大量炎細(xì)胞浸潤，肺泡塌陷，組織結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重。與百草枯組比較，經(jīng)枸杞多糖灌胃處理的PQ+LBP組大鼠肺部炎癥滲出顯著減少，炎細(xì)胞浸潤得到一定的緩解，肺組織結(jié)構(gòu)基本正常，見圖1。與對(duì)照組大鼠比較，百草枯組大鼠肺組織的濕/干重比和羥脯氨酸含量顯著增加(P<0.05)，而PQ+LBP組大鼠肺組織的濕/干重比和羥脯氨酸含量較百草枯組顯著降低(P<0.05)，見圖2。

圖1 各組大鼠肺組織切片(HE染色 ×100)

2.2 各組大鼠肺組織MPO、MDA和SOD水平比較與對(duì)照組比較，百草枯組大鼠肺組織中MPO活性和MDA含量顯著增加，而SOD活性降低(P<0.05)。與百草枯組比較，PQ+LBP組大鼠肺組織MPO活性和MDA含量下調(diào)(P<0.05)，而SOD水平顯著增加(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠肺組織MPO、MDA、SOD表達(dá)水平

2.3 各組大鼠肺組織IL-1β和TNF-α表達(dá)水平比較與對(duì)照組比較，百草枯組大鼠肺組織中IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)。與百草枯組比較，PQ+LBP組大鼠肺組織中IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05),說明枸杞多糖能夠降低大鼠肺組織中IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平，見表2。

表2 各組大鼠肺組織IL-1β、TNF-α表達(dá)水平

2.4 各組大鼠肺組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平比較與對(duì)照組比較，百草枯組大鼠肺組織Nrf2和HO-1的表達(dá)受到抑制(P<0.05)。PQ+LBP組大鼠肺組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平較百草枯組顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖3。

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與百草枯組比較，#P<0.05圖3 各組大鼠肺組織中Nrf2和HO-1分子蛋白表達(dá)水平

3 討 論

百草枯導(dǎo)致的肺損傷和肺纖維化是中毒患者死亡的主要原因[6]，其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚不明確，尋找有效的肺損傷和肺纖維化抑制劑對(duì)改善患者的預(yù)后具有重要意義[7]。近年來，多種中藥活性成分在不同病因?qū)е碌姆螕p傷治療方面的價(jià)值逐漸受到重視[8]。枸杞多糖作為枸杞的主要活性成分，主要由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、等多種水溶性復(fù)合多糖組成，具有重要的藥理學(xué)活性，包括抗癌、抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等作用[9-10]。

本研究通過構(gòu)建大鼠動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖能夠減輕百草枯中毒導(dǎo)致的肺損傷、減少肺組織滲出、減少肺組織羥脯氨酸的沉積。通過對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)分子MPO、MDA和SOD的檢測和比較發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖能夠降低MPO活性和MDA水平，上調(diào)SOD活性，提示枸杞多糖有助于提升清除自由基的能力、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、減少氧化應(yīng)激造成的組織損傷。而PQ+LBP組大鼠肺組織中IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平下調(diào)，表明枸杞多糖具有一定的抗炎作用。在相關(guān)分子機(jī)制研究方面，枸杞多糖處理后，大鼠肺組織Nrf2和HO-1蛋白水平上調(diào)，該通路參與多種組織器官的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，是機(jī)體重要的抗氧化損傷機(jī)制。此外，Nrf2/HO-1還具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)激、抗炎、減少線粒體損傷和抗凋亡等作用[11-12]。

對(duì)于其他病因引起的肺部疾患，枸杞多糖也能發(fā)揮一定的治療作用。Chen等[13]在小鼠和人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HPMECs)兩個(gè)水平研究枸杞多糖對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的保護(hù)作用及分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)：枸杞多糖能夠通過抑制NF-κB信號(hào)途徑發(fā)揮抗凋亡和抗氧化作用，減少內(nèi)皮細(xì)胞損傷，減輕肺部炎癥和水腫。也有報(bào)道枸杞多糖通過Akt/eNOS 通路減輕LPS致ARDS小鼠肺損傷，發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激及抗凋亡作用[14]。對(duì)于病情穩(wěn)定的慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者中，枸杞多糖能夠降低并穩(wěn)定血清缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)濃度，抑制病情加重[15]。在肺纖維化研究方面，枸杞多糖能夠抑制肺纖維化相關(guān)基因COL1A1和α-SMA的表達(dá)，減少肺組織羥脯氨酸的沉積，同時(shí)還能夠抑制成纖維細(xì)胞過度增殖和轉(zhuǎn)分化[16]。相關(guān)機(jī)制與百草枯中毒導(dǎo)致的肺纖維化發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，枸杞多糖是否能夠抑制上述過程進(jìn)而阻斷百草枯所致的肺纖維化有待探討。

綜上所述，本研究中，枸杞多糖作為一種重要的植物活性成分對(duì)百草枯誘導(dǎo)的肺損傷具有較好的保護(hù)作用，同時(shí)能夠發(fā)揮抗氧化應(yīng)激和抗炎活性，Nrf2/HO-1信號(hào)途徑可能參與這個(gè)過程。相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制及轉(zhuǎn)化應(yīng)用前景還需進(jìn)一步研究。