楊建榮 凌凱南 李碧錦 李 軍 季志強 劉菊珍

(廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院泌尿外科，南寧市 530021，電子郵箱：13907869384@139.com)

前列腺癌是男性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率具有明顯地區(qū)差異，而近年來中國前列腺癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢[1]。研究表明，前列腺癌的發(fā)生可能與遺傳、環(huán)境、性激素等有關[2]，其中遺傳因素在前列腺癌的發(fā)生中具有重要作用[3]。此外，前列腺上皮細胞的生長對雄激素具有依賴性，而雄激素的活性主要由雄激素受體(androgen receptor，AR)調控[4]。因此，AR在前列腺癌的發(fā)生中也扮演著重要角色。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指在基因組水平上單個核苷酸的變異而形成的遺傳標記，其可以調控基因表達,引起蛋白功能變化。目前，AR基因的SNP位點與前列腺癌之間關系的研究報道較少。故我們篩選AR相關SNP位點后，采用高分辨率溶解曲線分析技術檢測前列腺癌患者與健康體檢者AR基因rs5918762位點的基因型，并使用第一代測序Sanger法進行驗證，為闡明AR基因位點rs5918762多態(tài)性與前列腺癌的關系提供理論參考。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 選取2015年1月至2019年1月期間就診于廣西江濱醫(yī)院泌尿外科和廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科的85例前列腺癌患者作為前列腺癌組。納入標準：常居廣西5年以上；均經過兩名以上病理科高年資病理醫(yī)師閱片證實為前列腺癌；初治患者，未經放療或化療。排除標準：患有其他腫瘤疾病或合并嚴重心肺等嚴重疾病者；有嚴重并發(fā)癥或資料嚴重缺失者。另從這兩家醫(yī)院體檢中心納入85例同期健康體檢者(男性)作為正常對照組。納入標準：常居廣西5年以上；與前列腺癌組患者無遺傳學關聯(lián)性。排除標準：患有其他腫瘤疾病或合并嚴重心肺等嚴重疾病者；血清前列腺特異抗原(prostate specific antigen，PSA)>4 μg/L者。所有受試者均簽署知情同意書，本研究經廣西江濱醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2 資料收集 收集兩組研究對象的年齡、體質指數、居住地、血清PSA水平，以及前列腺癌患者的臨床分期、前列腺組織Gleason分級(根據世界衛(wèi)生組織最新標準[5]進行評估)等資料。

1.3 AR基因SNP位點的選擇策略 使用NCBI 的dbSNP數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)與SNPinfo數據庫(https://manticore.niehs.nih.gov/)篩選AR相關的SNP位點。篩選條件：(1)HapMap中中國人群中最小等位基因頻率≥5%；(2)多態(tài)位點位于3′UTR區(qū) ；(3)多態(tài)位點之間連鎖不平衡分析提示r2<0.8；(4)位點尚無前列腺癌相關研究和全基因組關聯(lián)性研究報告該位點；(5)在NCBI收錄文獻中有引用該位點。最終僅rs5918762位點符合要求。

1.4 標本收集與DNA提取 抽取研究對象清晨空腹肘靜脈血3～5 mL，采用乙二胺四乙酸抗凝后置于-80℃冰箱長期保存待用。采用天根生化科技(北京)有限公司DNA提取試劑盒(批號：OSR-M102)提取全血基因組DNA，進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，采用紫外分光光度計(日本島津公司，型號：UV-2450)測定260 nm波長的吸光度值，以測定DNA濃度。

1.5 PCR擴增 在NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中搜索AR基因(NM_001348064.1:c.)轉錄本附近序列，然后在NCBI primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi)輸入FASTA序列，選擇覆蓋rs5918762位點的引物，得到上游引物(GTGAGGACGGGCTGTAGAAG)和下游引物(GTGAGGACGGGCTGTAGAAG)，擴增片段長度198 bp，引物由廣西吉娃娃生物科技有限公司合成。PCR試劑盒購自TaKaRa公司(批號：DRR036A)，根據說明書進行反應體系的配置，反應體系包括SYBR Green Ⅰ mix(2×)5 μL、上游引物(10 μmol/L)0.3 μL、下游引物(10 μmol/L)0.3 μL、cDNA 0.4 μL，滅菌蒸餾水加至10 μL。PCR反應循環(huán)條件：95℃預變性5 min，95℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 40 s，共35個循環(huán)；最后72℃ 10 min，4℃保存至取出產物。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，置于-20℃冰箱中保存。

1.6 高分辨熔解曲線分析技術檢測AR基因rs5918762位點基因型 將9 μL PCR產物與1 μL飽和熒光染料(美國Idaho公司，批號：1000rnx)于暗室中依次加入96孔PCR板并混勻，加入1滴礦物油封液面；PCR反應：95℃ 30 s，25℃ 30 s，共1個循環(huán)，保持4℃；將96孔板4 000 r/min離心30 min后，放入LightScanner 384高分辨率溶解曲線突變檢測/基因分型分析系統(tǒng)(美國Idaho公司)中，分析溶解曲線，得出rs5918762位點基因型，并與酶切結果相互佐證。AR基因rs5918762位點基因型如圖1，其中紅色曲線代表基因型TT，綠色和藍色曲線分別代表基因型CT和CC。

圖1 AR基因rs5918762各基因型溶解曲線

1.7 一代測序Sanger法驗證 使用PCR產物純化試劑盒(德國QIAGEN公司，批號：28106)純化每個樣本的PCR擴增產物，鏈接到pUC19克隆載體(購自上海吉凱基因生物科技有限公司)上，轉化到感受態(tài)大腸桿菌進行擴增，并常溫培養(yǎng)24 h；經過藍白斑法篩選后挑選8個陽性克隆菌斑進行搖菌培養(yǎng)(溶菌肉湯培養(yǎng)基+50 mg/mL氨芐霉素，37℃烘箱培養(yǎng)15 h)后提取質粒DNA，并委托上海生工生物工程有限公司進行Sanger測序，通過NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)進行序列比對分析。

1.8 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示；計數資料以例數(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗；采用擬合優(yōu)度檢驗對各組基因進行Hardy-Weinberg平衡檢驗；采用Logistic回歸分析計算各基因型人群患前列腺風險的比值比(odds ratio,OR)及95%CI。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 研究人群的特征 兩組研究對象的年齡、體質指數、居住地差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，具有可比性，見表1。85例前列腺癌患者行血清PSA檢測，為(49.96±3.99)μg/mL，正常對照組血清PSA水平為(2.29±0.07)μg/mL。前列腺癌患者臨床分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期分別有4例(4.71%)、41例(48.24%)、21例(24.70%)、19例(22.35%)；Gleason評分≤7分、>7分各32例(37.65%)、51例(60.00%)，2例患者缺失記錄。

表1 兩組研究對象基線資料的比較[n(%)]

2.2 兩組研究對象AR基因rs5918762位點基因型分布頻率的比較 在兩組樣本中均檢測到位點變化。兩組研究對象在AR基因rs5918762位點上均以TT基因型為主(見表2)，與一代測序Sanger法檢測結果一致。Hardy-Weinberg平衡檢驗顯示兩組的P值均>0.05，說明群體基因遺傳平衡，數據來自同一群體，具有人群代表性，見表2。

兩組研究對象AR基因rs5918762位點基因型分布頻率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=14.155，P<0.001)，其中前列腺癌組AR基因rs5918762位點TC基因型與CC基因型比例均高于正常對照組，而TT基因型比例低于對照組，見表3。與攜帶AR基因rs5918762位點TT基因型者相比，攜帶AR基因rs5918762位點CC基因型者[OR=8.377，95%CI(1.286，9.729)，P=0.023]、TC基因型者[OR=3.630，95%CI(1.663,7.967，P=0.001)]患前列腺癌的風險增加。

表2 Hardy-Weinberg平衡檢驗[n(%)]

表3 兩組研究對象AR基因rs5918762位點基因型分布頻率的比較[n(%)]

2.3 AR基因rs5918762位點不同基因型前列腺癌患者的臨床病理特征的比較 3種基因型的前列腺患者的血清PSA水平、Gleason評分差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。與攜帶TT基因型患者相比，攜帶CC基因型患者的臨床分期Ⅲ～Ⅳ期比例更高(均P<0.05)，見表4。

表4 AR基因rs5918762位點不同基因型前列腺癌患者的臨床病理特征的比較[n(%)]

3 討 論

編碼人類AR的基因定位于X染色體的長臂q11-12，由919個氨基酸組成，含有8個外顯子和7個內含子，相對分子量約為111 000[6]。目前有關AR基因多態(tài)性與前列腺癌的相關性研究中，AR基因多態(tài)性位點主要包括位于第一外顯子區(qū)的(CAG)n和(GGN)n三核苷酸重復序列STR位點以及SNP位點[7]。目前多數學者認為，基因多態(tài)性可能通過影響AR的表達水平及轉錄活性，從而影響雄激素作用的信號傳導通路，以刺激前列腺上皮細胞的過度增生，進而促進前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展[8-9]。研究表明， AR基因E211G>A多態(tài)性與轉移性前列腺癌和雄激素性脫發(fā)的發(fā)生風險降低相關[10]。還有學者通過生信分析33個前列腺癌風險位點后發(fā)現，有1/3的SNP風險區(qū)域位于AR結合區(qū)域[11]。還有研究顯示，前列腺癌細胞的AR轉錄活性明顯增強，T877A基因突變導致AR轉錄活性增強是去勢抵抗性前列腺癌發(fā)生的機制之一[12-13]。以上研究表明，AR基因多個位點的多態(tài)性可能參與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展，但還需要分子生物學實驗進一步驗證。

本研究分析了AR基因rs5918762位點多態(tài)性與前列腺癌風險之間的關系，發(fā)現與正常對照組相比，前列腺癌組AR基因rs5918762位點TC基因型與CC基因型比例更高，而TT基因型比例更低(P<0.05)；與攜帶AR基因rs5918762位點TT基因型相比，攜帶AR基因rs5918762位點CC基因型、TC基因型的人群患前列腺癌的風險增加(均OR>1，P<0.05)。這提示AR基因rs5918762位點基因多態(tài)性可能與前列腺癌的發(fā)病有關，其中攜帶CC基因型、TC基因型的人群患病概率增加。此外，與攜帶AR基因rs5918762位點TT基因型相比，攜帶AR基因rs5918762位點CC基因型的前列腺癌患者臨床分期Ⅲ～Ⅳ期比例更高(均P<0.05)，這提示AR基因rs5918762位點基因多態(tài)性可能還與前列腺癌的病情發(fā)展有關，攜帶AR基因rs5918762位點CC基因型、TC基因型的前列腺癌患者的病情進展更快，可能預后亦相對更差。

本研究存在一些不足之處：(1)本文的研究對象僅來源于兩家醫(yī)院，樣本較少，且為回顧性研究，今后需要開展多中心、大樣本的前瞻性研究，以獲得更為確切、普適性更強的結論；(2)前列腺癌發(fā)病是多因素共同作用的結果，1個基因的SNP可能無法完全解釋疾病狀況，只能作為輔助診斷的依據，在今后的研究中應納入多因素綜合分析前列腺癌的發(fā)病影響因素。國際“千人基因組計劃”研究結果顯示，在東亞和南亞人群中，AR基因rs5918762位點的C等位基因頻率分別為0.997和0.908，T等位基因頻率分別為0.003和0.092(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)，由此可見CC基因型在亞洲人群更常見，與本研究結果相反；此外，本研究結果顯示，Gleason評分在AR基因rs5918762位點的TC或CC基因型與TT基因型患者之間不存在差異，這些可能也是上述因素所致。因此，AR基因rs5918762位點在前列腺癌發(fā)生和發(fā)展中的具體意義，還需要多中心大樣本研究一步證實，而其影響機制也還需要進一步分子生物學實驗驗證。

總之，AR基因rs5918762位點的多態(tài)性可能與前列腺癌易感性和疾病發(fā)展有關，且攜帶AR基因rs5918762位點的CC或TC基因型者前列腺癌易感性增加，攜帶CC基因型的前列腺癌患者疾病進展可能更快。