向春燕 ，況 剛 ，盤思穎 ，李月平 △

（1. 重慶市黔江食品藥品檢驗所，重慶 409003； 2. 重慶第二師范學院，重慶 400067）

小兒健脾丸具有健脾功效，臨床廣泛用于治療脾胃虛弱引起的消化不良、體弱虛力等，全方由白術、茯苓、甘草、六神曲、南山楂、陳皮等15 味中藥材組方，方中白術、茯苓、南山楂均有健脾功效，蓮子清熱燥濕，陳皮理氣健脾，六神曲健脾和胃、消食調(diào)中，甘草補脾益氣、調(diào)和諸藥［1－2］?，F(xiàn)行質(zhì)量標準為《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑（第二十冊）》（WS3－B－3755－98），但僅收載藥品性狀項，茯苓、山藥、甘草、南山楂、砂仁的顯微鑒別項，丸劑的一般檢查項，無含量測定項，質(zhì)量標準的整體控制水平不全面。本研究中采用薄層色譜（TLC）法對小兒健脾丸中的陳皮進行定性鑒別，并建立了測定方中甘草酸含量的高效液相色譜（HPLC）法，以進一步提高該藥的質(zhì)量控制水平?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Linomat 5 型薄層點樣成像儀（瑞士Camag 公司），配有CAMAG－Scanner3 型薄層掃描儀；HH－6 型電熱恒溫水浴鍋（常州榮華儀器制造有限公司）；JP－500C型高速多功能粉碎機（永康市久品工貿(mào)有限公司）；GZX－9076MBE 型電熱鼓風干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；MSA225S 型電子天平（德國賽多利斯科學儀器有限公司，精度為十萬分之一）；XPE204 型電子天平（梅特勒－托利多集團公司，精度為萬分之一）；Milli Direct － Q16 型（超）純水機（美國密理博公司）；Agilent 1260 型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），配有在線脫氣機、四元梯度泵、自動進樣器、G4212B 型二極管陣列（DAD）檢測器、色譜工作站；SB－800DT 型超聲波提取器（寧波新芝生物科技股份有限公司，功率為800 W，頻率為40 kHz）；硅膠G 薄層板（青島海洋化工有限公司，批號為20180225）。

1.2 試藥

小兒健脾丸（T 公司，批號分別為 19010721，19010722，19010723）；橙皮苷對照品（批號為 110721 －201617，含量為 96.1% ），甘草酸銨對照品（批號為 110731 －201619，含量為93.0%），均購自中國食品藥品檢定研究院；人參（宜賓仁和中藥飲片有限責任公司，批號為190801）；白術（四川皓博藥業(yè)有限公司，批號為201202）；茯苓（成都仁濟宏藥業(yè)有限公司，批號為200201）；甘草（重慶三立堂中藥制藥有限公司，批號為210601）；陳皮（四川云亳堂藥業(yè)有限公司，批號為180301）；法半夏（重慶泰爾森制藥有限公司，批號為200101－07）；白扁豆（重慶百味珍藥業(yè)有限公司，批號為200101）；山藥（湖南省松齡堂中藥飲片有限公司，批號為200201）；蓮子（四川云亳堂藥業(yè)有限公司，批號為190701）；南山楂（梧州市亳海藥業(yè)有限公司，批號為E081a1301010）；六神曲（麩炒，四川輔正藥業(yè)有限公司，批號為151019）；炒麥芽（安徽敬道生物科技有限公司，批號為171102）；玉竹（北京同仁堂＜安國＞有限責任公司，批號為200401）；桔梗（江西和碩藥業(yè)有限公司，批號為190801）；砂仁（四川和順康藥業(yè)有限公司，批號為171102）；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 陳皮 TLC 鑒別

取橙皮苷對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.5mg／mL的對照品溶液。取樣品1 g，精密稱定，剪碎，加甲醇50 mL，超聲處理（功率為 800 W，頻率為 40 kHz）45 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。按小兒健脾丸處方和工藝制備缺陳皮的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。分別吸取 2 μL 供試品溶液和陰性對照品溶液、10 μL 對照品溶液，點于 0.1% NaOH 硅膠 G 板上。按 2020 年版《中國藥典（四部）》0502 項下薄層色譜法試驗，以乙酸乙酯 － 甲醇 － 水溶液（100 ∶17 ∶10，V ／ V ／ V）為展開劑，展開13 cm，取出，晾干，噴以5% AlCl3試液，加熱5 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜圖中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 薄層色譜圖1.Negative reference solution 2 － 4.Test solution 5.Hesperidin reference solutionFig.1 TLC chromatograms

2.2 甘草酸含量測定

2.2.1 色譜條件［3］

色譜柱：Agilent Zorbax SB－C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈 － 0.2% 磷酸水溶液（35 ∶65，V ／ V）；流速：1.0 mL ／ min；檢測波長：250 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

取甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為 0.05 mg ／mL 的對照品溶液。取樣品 1 g，剪碎，精密稱定，加甲醇25 mL，超聲處理（功率為800 W，頻率為40 kHz）45 min，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方工藝制備缺甘草的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2.2 項下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，結(jié)果供試品溶液色譜圖中，在與甘草酸銨對照品溶液色譜相同保留時間處有色譜峰出現(xiàn)，且陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖1.ammonium glycyrrhizinateA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

線性關系考察：分別吸取2.2.2 項下對照品溶液2，3，5，10，15 mL，置 20 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以甘草酸銨對照品溶液進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y ＝7 640.2 X ＋0.243 5（r ＝ 0.999 9，n ＝ 5）。結(jié)果表明，甘草酸銨進樣量在 0.004 9 ～ 0.036 9 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。

檢測限及定量限確定：精密吸取甘草酸銨對照品溶液（質(zhì)量濃度為 0.153 9 μg ／mL）10 μL，按 2.2.1 項下色譜條件進樣測定。以信噪比（S／ N）為 3 ∶1 時的含量為檢測限，以 S／ N 為10 時的含量為定量限，結(jié)果甘草酸銨的檢測限和定量限分別為1.39 ng 和4.64 ng。

精密度試驗：精密吸取2.2.2 項下對照品溶液適量，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD 為1.09%，表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批（批號為19010721）樣品6 份，按 2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按 2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果的 RSD為 0.70%（n ＝6），表明方法重復性良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批（批號為19010721）樣品，依法制備供試品溶液，分別于室溫下放置 0，2，4，6，12，24 h 時按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD 為 0.47%（n ＝ 6），表明供試品溶液在室溫放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為19010721）6 份，精密稱定，置錐形瓶中，精密量取對照品溶液（質(zhì)量濃度為 0.024 6 mg ／mL）1 mL，按 2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 甘草酸銨加樣回收試驗結(jié)果（n ＝6）Tab.1 Results of the recovery test of ammonium glycyrrhizinate（n ＝6）

2.2.4 樣品中甘草酸含量測定

取 3 批（批號分別為 19010721，19010722，19010723）樣品，按 2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按 2.2.1 項下色譜條件進樣測定3 次，記錄峰面積，并計算樣品中甘草酸的含量（甘草酸含量＝甘草酸銨含量／1.020 7）。結(jié)果樣品中甘草酸的含量分別為 0.386 3，0.386 5，0.387 3 mg ／g，平均含量為 0.386 7 mg ／g。

3 討論

3.1 TLC 條件選擇

參考 2020 年版《中國藥典（一部）》和文獻［4 －16］，考察了7 個常見的且展開效果較好的展開系統(tǒng)，即乙酸乙酯－甲醇－水，甲苯－乙酸乙酯－甲酸－水的上層溶液，三氯甲烷－甲醇－水在10 ℃以下過夜的下層溶液，乙酸乙酯－甲醇－水，醋酸乙酯－甲醇－水－濃氨溶液，乙酸乙酯－甲醇－水，醋酸乙酯－丁酮－甲酸－水，甲酸乙酯－甲醇－水，結(jié)果以乙酸乙酯－甲醇－水為展開劑時的效果最好?？疾炝? 種展開方法：1）使用乙酸乙酯 － 甲醇 －水（100 ∶17 ∶13，V ／ V ／ V）展開，甲苯 －乙酸乙酯 － 甲酸 －水（20 ∶10 ∶1 ∶1，V ／ V ／ V ／ V）上層溶液進行二次展開；2）乙酸乙酯 － 甲醇 － 水（100 ∶17 ∶10，V／ V／ V）。結(jié)果一次展開時圖譜更清晰，影響因素較少?？疾炝俗灾乒枘zG 板、市售硅膠G 板和自制堿板，結(jié)果比移值均在 0.2 ～ 0.8 之間，展開效果較好。故 TLC 條件確定為于乙酸乙酯－甲醇－水溶液中一次展開，點樣于 0.1%NaOH 硅膠 G 板上。

3.2 甘草提取方法選擇

考察了水浴加熱回流提取和超聲提取2 種方法，分別精密加入30%，50%，70%，95%甲醇溶液各50 mL，回流提取和超聲提取30，45，60 min。在水浴加熱回流提取法中，提取率隨回流時間、乙醇和甲醇濃度的增加而增加，95%甲醇回流30 min 時提取效果最佳；在超聲提取法中，提取率隨甲醇濃度、超聲時間的增加而增加，95%甲醇超聲45 min 時提取效果最佳。考慮回流提取比超聲提取復雜，最終以95%甲醇超聲提取45 min 為提取方法。

3.3 HPLC 條件選擇

考察了流動相乙腈－0.2%磷酸水溶液的3 種比例（37 ∶63，35 ∶65，36 ∶64， V ／ V），結(jié)果目標峰均能較好分離，但流動相比例為 35 ∶65（ V ／ V）的分離度更好，且峰形對稱，符合系統(tǒng)適用性試驗要求?？疾炝瞬煌V柱溫度（20，25，30 ℃）及不同品牌色譜柱（Waters RP －C18柱、Insert Sustain C18柱、Agilent Zorbax C18柱，規(guī)格均為250 mm ×4.6 mm，5 μm）對含量測定結(jié)果的影響，結(jié)果色譜柱溫度和品牌不影響含量測定結(jié)果，故最終確定2.2.1 項下色譜條件。

3.4 方法評價

該方法操作簡便，結(jié)果準確，專屬性強，穩(wěn)定性和重復性均較好，可用于小兒健脾丸的質(zhì)量控制。