尚念紅

口腔癌是最常見的頭頸癌類型，口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）占口腔癌總數(shù)的約90%，全世界每年診斷出新病例超過(guò)30萬(wàn)。雖然OSCC 的診斷和臨床治療方面取得了一定進(jìn)步，但OSCC 病人的5年總生存率無(wú)顯著提高，仍然小于50%。因此，探究OSCC發(fā)生和進(jìn)展的分子機(jī)制對(duì)于鑒定新的、有效治療靶標(biāo)是必不可少的。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內(nèi)源性、小的非編碼RNA分子，長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸。它們通過(guò)與靶mRNA 的3′非翻譯區(qū)（3′-UTR）中的互補(bǔ)序列結(jié)合并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平的基因表達(dá)來(lái)影響腫瘤的生物學(xué)過(guò)程。目前已證明多種miRNA 參與OSCC 的生理和病理過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、代謝和分化。例如，如miR-133a-3p 在OSCC 中的表達(dá)降低并充當(dāng)腫瘤抑制因子，miR-196a-5p 在OSCC 細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用，miR-361-5p表達(dá)下調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和OSCC預(yù)后不良。這些發(fā)現(xiàn)支持miRNA 在口腔腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中的起關(guān)鍵作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，與正常健康組織相比，OSCC 組織中miR-7-5p 的表達(dá)量明顯下調(diào)。miR-7-5p 在人類幾種癌癥類型中異常表達(dá)，包括非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌和食管鱗狀細(xì)胞癌。然而，miR-7-5p 在人OSCC 中的潛在作用和作用機(jī)制仍有待確定。因此本實(shí)驗(yàn)旨在探究miR-7-5p 對(duì)OSCC 細(xì)胞增殖和凋亡的影響及可能的作用機(jī)制，研究起止時(shí)間為2018年3—10月。

1 材料與方法

1.1 材料

人正?？谇火つこ衫w維細(xì)胞株hOMF由上海艾研生物科技有限公司提供；OSCC 細(xì)胞株SCC25、Cal127 和Tca8113 由美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)提供；RPMI 1640 培養(yǎng)基由美國(guó)Hyclone 公司提供；胎牛血清、Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑由美國(guó)Invitrogen公司提供；miR-7-5p模擬物（miR-7-5p mimics）及陰性對(duì)照序列（mimics Control）由廣州銳博生物科技有限公司提供；Trizol 試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒由賽默飛世爾公司提供；SYBR Primix Ex Taq 檢測(cè)試劑盒由日本TaKaRa公司提供；噻唑藍(lán)（MTT）試劑由美國(guó)Sigma 公司提供；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒由大連TaKaRa公司提供；RIPA 細(xì)胞裂解液、BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、蛋白發(fā)光液均由上海碧云天生物技術(shù)研究所提供；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜由美國(guó)Millipore 公司提供；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒由美國(guó)Promega 公司提供；鋅指蛋白核轉(zhuǎn)錄因子4（KLF4）3′-UTR 野生型（KLF4-Wt）和KLF43′-UTR 突變型（KLF4-Mut）熒光素酶重組載體質(zhì)粒由廣州輝駿生物科技有限公司提供；KLF4 抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體由美國(guó)Abcam 公司提供；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的免疫球蛋白G（IgG）由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

OSCC細(xì)胞SCC25、Cal127、Tca8113及正常口腔黏膜成纖維細(xì)胞hOMF 均培養(yǎng)在含10%胎牛血清和1% 青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置5%二氧化碳、37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，待細(xì)胞鋪滿瓶底90% 時(shí)用胰蛋白酶消化細(xì)胞，以1∶3 比例進(jìn)行傳代，取處對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

將OSCC細(xì)胞SCC25接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中，過(guò)夜培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度為50% 時(shí)，使用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑將miR-7-5p mimics（終濃度為50 nmol/L）及mimics Control（終濃度為50 nmol/L）分別轉(zhuǎn)染至SCC25 細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為三組：Control組（未轉(zhuǎn)染的SCC25細(xì)胞）、NC組（轉(zhuǎn)染mimics Control 的SCC25 細(xì)胞）、miR-7-5p 組（轉(zhuǎn)染miR-7-5p mimics 的SCC25 細(xì)胞）。轉(zhuǎn)染6 h 時(shí)更換新的培養(yǎng)液，于37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測(cè)

分別采用Trizol 法提取OSCC 細(xì)胞SCC25、Cal127、Tca8113 及正?？谇火つこ衫w維細(xì)胞hOMF 中總RNA，提取轉(zhuǎn)染48 h 后各組SCC25 細(xì)胞中總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書配制反應(yīng)體系，并合成第一鏈互補(bǔ)DNA（cDNA），然后使用SYBR Primix Ex Taq 檢測(cè)試劑盒以cDNA 為模板，進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)。以U6 為內(nèi)參，分析細(xì)胞中miR-7-5p mRNA 相對(duì)表達(dá)量，擴(kuò)增條件設(shè)置為：95 ℃5 min，95 ℃20 s，60 ℃30 s，72 ℃15 s，共設(shè)40個(gè)循環(huán)，以相對(duì)量2法進(jìn)行計(jì)算。采用同樣的方法分析轉(zhuǎn)染48 h 后各組SCC25 細(xì)胞中KLF4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

1.5 MTT 法檢測(cè)

分別將轉(zhuǎn)染24、48、72 h 后各組SCC25 細(xì)胞種植到96 孔板中，每組細(xì)胞在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，向每孔細(xì)胞中加入濃度為5 g/L 的MTT 溶液20 μL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，棄去上清培養(yǎng)液，再向細(xì)胞中加入150 μL 二甲基亞砜溶液，混勻后繼續(xù)孵育30 min，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔細(xì)胞450 nm波長(zhǎng)處吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

分別收集轉(zhuǎn)染48 h 后各組SCC25 細(xì)胞，約為1×10個(gè)細(xì)胞，以PBS洗滌2 次，向細(xì)胞中加入100 μL Bingding Buffer 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，向細(xì)胞懸液中加入Annexin VFITC 試劑10 μL，輕輕混勻，在室溫下避光反應(yīng)15 min，離心收集細(xì)胞，再加入預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，再向細(xì)胞懸液中加入PI 染液10 μL，避光孵育5 min，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)各組SCC25細(xì)胞凋亡情況。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

TargetScan 等生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，KLF43′-UTR 存在與miR-7-5p 靶向結(jié)合的位點(diǎn)，提示KLF4 可能是miR-7-5p 直接靶基因。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果分別構(gòu)建KLF4-Wt載體質(zhì)粒和KLF4-Mut載體質(zhì)粒，該部分由廣州輝駿生物科技有限公司完成。將KLF4-Wt 和KLF4-Mut 載體質(zhì)粒分別與miR-7-5p mimics 或mimics Control 共轉(zhuǎn)染至SCC25 細(xì)胞，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染48 h 后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，計(jì)算各組細(xì)胞相對(duì)熒光活性。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)

收集轉(zhuǎn)染48 h 后各組SCC25 細(xì)胞，加入RIPA 細(xì)胞裂解液，在冰上裂解提取細(xì)胞中總蛋白，使用BCA 檢測(cè)試劑盒對(duì)蛋白樣品進(jìn)行定量檢測(cè)，取40 μg 蛋白樣品行SDS-PAGE 電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，將膜置于5% 脫脂奶粉中封阻1 h，PBST 洗膜3 次，然后加入1∶1000 稀釋的KLF4 一抗，4 ℃過(guò)夜雜交，PBST 洗膜3 次，加入1∶3000 稀釋的二抗，室溫雜交2 h，PBST洗膜3 次，加入ECL 發(fā)光液，顯影、成像、拍照，以GAPDH 為內(nèi)參條帶，采用Image J 圖像分析軟件分析條帶灰度，分別計(jì)算各組SCC25 細(xì)胞中KLF4 蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 miR-7-5p 在OSCC 細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)

qRTPCR 結(jié)果顯示，miR-7-5p 在人正?？谇火つこ衫w維細(xì)胞hOMF 及3 種不同OSCC 細(xì)胞中的表達(dá)量比較，

F

=319.810，

P

＜0.001。 與hOMF（1.00±0.09）比較，miR-7-5p 在3 種不同OSCC 細(xì)胞SCC25（0.21±0.02）、Cal127（0.43±0.04）和Tca8113（0.48±0.05）中的表達(dá)量有不同程度的下調(diào)（

P

＜0.05）。在3 種不同OSCC細(xì)胞中，SCC25細(xì)胞miR-7-5p的基礎(chǔ)表達(dá)量最低，因此選擇SCC25細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 miR-7-5p mimics 轉(zhuǎn)染效果檢測(cè)

qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，Control 組、NC 組及miR-7-5p 組SCC25細(xì)胞中miR-7-5p 的表達(dá)量比較，

F

=547.999，

P

＜0.001。miR-7-5p 組（5.96±0.62）明顯高于Control 組（1.00±0.11）和NC 組（0.97±0.10）（

P

＜0.05），而Control 組和NC 組相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。提示過(guò)表達(dá)miR-7-5p的SCC25細(xì)胞株構(gòu)建成功。

2.3 過(guò)表達(dá)miR-7-5p 抑制SCC25 細(xì)胞增殖

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-7-5p 組SCC25 細(xì)胞吸光度在48 h和72 h時(shí)低于Control組和NC組（

P

＜0.05），Control 組和NC 組SCC25 細(xì)胞在24、48、72 h 時(shí)吸光度均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。表明miR-7-5p 過(guò)表達(dá)能夠抑制SCC25細(xì)胞增殖。見表1。

表1 過(guò)表達(dá)miR-7-5p對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌SCC25細(xì)胞24、48、72 h時(shí)增殖吸光度的影響/±s

2.4 過(guò)表達(dá)miR-7-5p 促進(jìn)SCC25細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，Control 組、NC 組及miR-7-5p組SCC25 細(xì)胞凋亡率比較，

F

=23.168，

P

＜0.001。miR-7-5p 組SCC25 細(xì)胞凋亡率（24.41±8.15）%明顯高于Control 組（9.48±2.65）% 和NC 組（10.21±3.02）%（

P

＜0.05），而Control 組和NC 組SCC25 細(xì)胞凋亡率相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。說(shuō)明miR-7-5p過(guò)表達(dá)能夠誘導(dǎo)SCC25細(xì)胞發(fā)生凋亡。

2.5 miR-7-5p 靶向調(diào)控KLF4 基因

TargetScan 等生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示（圖1A），miR-7-5p與KLF43′-UTR存在互補(bǔ)配對(duì)堿基，提示KLF4可能是miR-7-5p 的直接靶基因。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析結(jié)果表明，與NC 組（1.00±0.10）比較，KLF4-Mut載體質(zhì)粒miR-7-5p mimics 轉(zhuǎn)染后SCC25細(xì)胞相對(duì)熒光活性（1.00±0.11）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=0.117，

P

=0.913），而KLF4-Wt 載體質(zhì)粒miR-7-5p mimics 轉(zhuǎn)染后SCC25 細(xì)胞相對(duì)熒光活性（0.26±0.03）降低（

t

=16.830，

P

＜0.001），提示miR-7-5p 能夠靶向結(jié)合野生型KLF43′-UTR 序列。qRT-PCR 結(jié)果顯示，miR-7-5p 組SCC25 細(xì)胞中KLF4 mRNA（0.33±0.03）低于NC 組（1.00±0.10）（

t

=11.115，

P

＜0.001），蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果（圖1B）也顯示其蛋白表達(dá)水平（0.42±0.04）低于NC 組（0.12±0.01）（

t

=12.603，

P

＜0.001）。 提示miR-7-5p 能夠負(fù)向調(diào)控KLF4的表達(dá)。

圖1 miR-7-5p靶向調(diào)節(jié)鋅指蛋白核轉(zhuǎn)錄因子4（KLF4）：A為miR-7-5p和KLF43′非翻譯區(qū)（3′-UTR）靶向結(jié)合示意圖；B為蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)NC組與miR-7-5p組口腔鱗狀細(xì)胞癌SCC25細(xì)胞中KLF4蛋白表達(dá)水平

3 討論

多項(xiàng)研究表明miRNA 在多種癌癥的生物學(xué)特征中具有十分重要的作用，如細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移。miRNA 在多種癌癥中的關(guān)鍵作用支持其作為治療靶標(biāo)的潛在用途。近年來(lái)已經(jīng)報(bào)道了多種miRNA參與OSCC的發(fā)生和發(fā)展，可作為OSCC診斷和治療的分子標(biāo)志物。miR-7-5p 屬于miR-7 家族，其在多種癌癥類型中表達(dá)下調(diào)，表明其在腫瘤發(fā)生和腫瘤進(jìn)展中的起重要作用。據(jù)報(bào)道，miR-7-5p 在胃癌中下調(diào)并與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，miR-7-5p 通過(guò)調(diào)控PTEN/PI3K/AKT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制胃癌細(xì)胞侵襲和遷移。Zhu 等報(bào)道，miR-7-5p 在胰腺導(dǎo)管腺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)顯著下降，細(xì)胞功能測(cè)定表明，miR-7-5p 通過(guò)靶向SOX18 抑制PANC-1 細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲。miR-7-5p 在腫瘤中表現(xiàn)出低表達(dá)，并且是關(guān)鍵的負(fù)調(diào)節(jié)因子。之前的研究顯示，與鄰近的正常組織相比，miR-7-5p 在OSCC 組織中表達(dá)下調(diào)。鑒于此，我們推測(cè)miR-7-5p 在OSCC 中也可能起到腫瘤抑制作用。然而，目前未見關(guān)于OSCC 中miR-7-5p 的表達(dá)或功能的研究。本研究初步證實(shí)了miR-7-5p 作為腫瘤抑制劑起作用，抑制OSCC 的發(fā)展。在本實(shí)驗(yàn)中，miR-7-5p 在OSCC 細(xì)胞系中的表達(dá)明顯低于人正?？谇火つこ衫w維細(xì)胞。研究表明，miR-7-5p的過(guò)表達(dá)能夠抑制OSCC 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，miR-7-5p 通過(guò)直接靶向其mRNA 的3'-UTR 而負(fù)調(diào)節(jié)KLF4表達(dá)。

KLF4作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，其參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡，并參與正常組織穩(wěn)態(tài)的發(fā)展和維持。越來(lái)越多的證據(jù)表明，KLF4在癌癥進(jìn)展和發(fā)展中起著抑癌或致癌基因的關(guān)鍵作用。目前研究顯示，KLF4 在OSCC 中呈高表達(dá)，扮演致癌基因的角色。最近報(bào)道指出，miR-7-5p 介導(dǎo)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的活性以抑制包括KLF4 致癌基因，其抑制正常細(xì)胞（至少乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A）發(fā)展成癌細(xì)胞。Huang 等研究發(fā)現(xiàn)，KLF4 可作為miR-7的靶標(biāo)參與環(huán)狀RNA ciRS-7調(diào)節(jié)的食管鱗狀細(xì)胞癌的遷移和侵襲。microRNA-轉(zhuǎn)錄因子自我調(diào)節(jié)反饋環(huán)是基因表達(dá)的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵機(jī)制，反饋環(huán)的失調(diào)與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展緊密相關(guān)。Wei等研究發(fā)現(xiàn)，KLF4-miR-7 自身調(diào)節(jié)反饋環(huán)的不平衡通過(guò)削弱microRNA 加工促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。以上研究表明，miR-7 可能通過(guò)調(diào)節(jié)KLF4 的表達(dá)在腫瘤中發(fā)揮作用。為了更好地理解miR-7-5p 的腫瘤抑制作用，本實(shí)驗(yàn)使用生物信息學(xué)軟件分析并鑒定KLF4作為miR-7-5p 的靶基因。使用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)測(cè)定，進(jìn)一步證實(shí)KLF4 是miR-7-5p 的直接靶標(biāo)。miR-7-5p 過(guò)表達(dá)伴隨著OSCC 細(xì)胞中KLF4的表達(dá)下調(diào)。提示miR-7-5p 抑制SCC25 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能與靶向調(diào)節(jié)KLF4的表達(dá)有關(guān)。

總之，miR-7-5p 在OSCC 細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，并通過(guò)抑制KLF4 起到腫瘤生長(zhǎng)抑制劑的作用。新發(fā)現(xiàn)的miR-7-5p/KLF4 軸提供了對(duì)OSCC 發(fā)生機(jī)制的深入了解，并為OSCC 提供了潛在的治療靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)只在SCC25 細(xì)胞中探究miR-7-5p 靶向KLF4 基因?qū)CC25 細(xì)胞增殖和凋亡的影響尚顯不足，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將在不同細(xì)胞系及動(dòng)物模型中進(jìn)行證實(shí)。