李娜，榮金鳳，徐艷

卵巢癌是威脅女性健康的惡性腫瘤之一，其早期發(fā)病較為隱匿且極易出現(xiàn)擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移，調(diào)查顯示卵巢癌病人5年生存率較低。目前臨床采用手術(shù)結(jié)合放化療等手段治療卵巢癌，但腫瘤細(xì)胞對(duì)放射治療極易產(chǎn)生耐受性而降低治療效果。因而如何提高腫瘤細(xì)胞放射敏感性成為重點(diǎn)研究問題。miRNA 異常表達(dá)可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞放射敏感性。因而積極尋找與卵巢癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子靶點(diǎn)對(duì)提高細(xì)胞放射敏感性具有重要意義。研究表明微小RNA-374a（miR-374a）在卵巢癌中上調(diào)表達(dá)并可降低細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。但miR-374a對(duì)卵巢癌放射敏感性的影響尚未可知。TargetScan預(yù)測(cè)顯示脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）可能是miR-374a 的靶基因，研究表明Syk 低表達(dá)與卵巢癌病人臨床病理特征相關(guān)。本研究探討miR-374a 對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移及侵襲的影響及其與放射敏感性的關(guān)系，初步分析miR-374a 對(duì)Syk 的靶向調(diào)控作用，試圖闡明miR-374a 在卵巢癌發(fā)展及治療中的作用機(jī)制，旨在為卵巢癌放射治療提供新方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以2017年2月至2018年1月在宜賓市第二人民醫(yī)院接受治療的63 例卵巢癌病人為研究對(duì)象，所有病人均接受手術(shù)切除治療。以卵巢癌癌旁組織為對(duì)照，術(shù)中切除卵巢癌組織及癌旁組織，病人年齡（65.85±3.87）歲，范圍為50～70 歲。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，入組病人知情且簽署同意書。

1.2 材料與試劑

卵巢癌A2780 細(xì)胞購自美國ATCC 公司。Trizol 試劑購自北京嘉美紐諾生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司；miR-374a特異性寡核苷酸抑制劑（antimiR-374a）及陰性對(duì)照（anti-miR-NC）、Syk 小干擾RNA（si-Syk）與陰性對(duì)照si-NC 均購自廣州銳博生物科技有限公司；Lipofectamine2000 購自美國Thermo Fisher 公司；Transwell 小室與Matrigel 基質(zhì)膠均購自美國BD公司；噻唑藍(lán)（MTT）細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購自上?；鶢栴D生物科技有限公司；兔抗人細(xì)胞周期蛋白1（cyclin D1）、細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A（cell cycle dependent protein kinase inhibitor 1A，P21）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；上皮鈣黏素（E-cadherin）抗體購自美國R&D Systems 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1

實(shí)驗(yàn)處理與分組 A2780細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱環(huán)境條件為37 ℃、5% 二氧化碳體積分?jǐn)?shù)、相對(duì)濕度95%。細(xì)胞80% 融合時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以隨機(jī)數(shù)字表法分成anti-miR-NC 組（細(xì)胞中轉(zhuǎn)染anti-miR-NC）、anti-miR-374a 組（細(xì)胞中轉(zhuǎn)染anti-miR-374a）、anti-miR-374a+si-NC 組（細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染anti-miR-374a 與si-NC）、anti-miR-374a+si-Syk 組（細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染anti-miR-374a 與si-Syk），轉(zhuǎn)染步驟參照Lipofectamine2000 說明書。收集轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2

實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測(cè)miR-374a 表達(dá) 取凍存卵巢癌及癌旁組織冰上溶解，分別加入Trizol 試劑提取總RNA（各組卵巢癌A2780 細(xì)胞復(fù)蘇后加入Trizol 試劑），利用Nanodrop2000c 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度，加入無核糖核酸酶水稀釋RNA（50 mg/L），參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成互補(bǔ)DNA（cDNA），據(jù)SYBR? Premix Ex Taq?Ⅱ試劑盒配置反應(yīng)體系進(jìn)行qRT-PCR。2算法計(jì)算miR-374a相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3

MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長期A2780細(xì)胞接種于96孔板（3×10個(gè)/孔），分別于轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h 時(shí)向各孔添加20 μL MTT 溶液，孵育4 h后，棄上清，依次150 μL 二甲基亞砜，低速振蕩至結(jié)晶溶解。酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處各孔吸光度。

1.3.4

Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲 侵襲實(shí)驗(yàn)：將稀釋的Matrigel平鋪于上室，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育5 h，取各組A2780 細(xì)胞接種于上室（5×10個(gè)/孔），取600 μL含血清培養(yǎng)液接種下室。孵育24 h后，多聚甲醛固侵襲細(xì)胞，結(jié)晶紫染液染色。顯微鏡下計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)。以未經(jīng)Matrigel 基質(zhì)膠包裹的小室進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)，其余步驟參考侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.3.5

克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞敏感性 anti-miRNC 組、anti-miR-374a 組、anti-miR-374a+si-NC 組、anti-miR-374a+si-Syk 組細(xì)胞經(jīng)0、2、4、6、8 Gy 照射劑量射線照射（劑量率0.36 Gy/min），收集放射處理的細(xì)胞，0.25% 胰蛋白酶消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)后接種于24孔培養(yǎng)皿中（3×10個(gè)/毫升），分別加入DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10～15 d，棄培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）洗滌，甲醇固定后進(jìn)行結(jié)晶紫染色。計(jì)算細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，參照單擊多靶模型計(jì)算細(xì)胞放射增敏比。

1.3.6

雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將含有結(jié)合位點(diǎn)Syk 的3’非翻譯區(qū)（UTR）序列及突變位點(diǎn)的Syk的3’UTR 序列別插入pGL3 載體分別構(gòu)建成WTSyk、MUT-Syk 重組載體，分別將重組載體與miR-374a mimics、miR-NC 共轉(zhuǎn)染至卵巢癌A2780 細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組分成miR-NC 組（WT-Syk）、miR-374a 組（WT-Syk）、miR-NC 組（MUT-Syk）、miR-374a 組（MUT-Syk），收集培養(yǎng)48 h細(xì)胞檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3.7

蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)Syk、cyclin D1、MMP-2、P21、E-cadherin 蛋白表達(dá) 提取A2780 細(xì)胞總蛋白，按照蛋白變性→十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳→轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜→封閉膜→一抗稀釋液（1∶1000）孵育→二抗稀釋液（1∶2000）孵育→化學(xué)發(fā)光顯色步驟進(jìn)行。ImageJ 軟件分析各條帶相對(duì)于內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 miR-374a 在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

卵巢癌組織中miR-374a 的表達(dá)水平（0.92±0.09）高于癌旁組織（0.28±0.03）（

t

=53.546，

P

＜0.001）。

2.2 抑制miR-374a 表達(dá)對(duì)細(xì)胞A2780 生物學(xué)行為及放射敏感性的影響

anti-miR-374a 組卵巢癌A2780 細(xì)胞遷移與侵襲數(shù)、cyclin D1 和MMP-2 蛋白表達(dá)、增殖活力低于anti-miR-NC 組（

P

＜0.05），P21、E-cadherin 蛋白表達(dá)水平高于anti-miR-NC 組（

P

＜0.05），見圖1、圖2、表1、表2。anti-miR-374a 組卵巢癌A2780 細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)低于anti-miR-NC 組（

P

＜0.05），增敏比明顯高于anti-miR-NC組，見表3，4。

圖2 抑制miR-374a表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞A2780增殖、遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

表1 抑制miR-374a表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞A2780增殖的影響/±s

表2 抑制miR-374a表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞A2780遷移、侵襲的影響/±s

表3 抑制miR-374a表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞A2780存活分?jǐn)?shù)的影響/±s

圖1 抑制miR-374a表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞A2780遷移、侵襲的影響（結(jié)晶紫染色×200）

2.3 miR-374a 靶向、調(diào)控Syk

TargetScan 預(yù)測(cè)顯示Syk 的3’UTR 含有miR-374a 的結(jié)合位點(diǎn)，見圖3。與miR-NC 組（WT-Syk）比較（0.99±0.10），miR-374a組（WT-Syk）熒光素酶活性降低（0.22±0.02）（

t

=18.495，

P

＜0.001）；而miR-NC 組（MUT-Syk）（1.03±0.10）熒光素酶活性與miR-374a 組（MUT-Syk）（0.96±0.10）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=1.212，

P

=0.253）。

圖3 TargetScan預(yù)測(cè)脾酪氨酸激酶（Syk）的3’UTR與miR-374a的結(jié)合位點(diǎn)

表4 細(xì)胞放射增敏比單擊多靶模型參數(shù)

miR-NC 組、miR-374a 組、anti-miR-NC 組、antimiR-374a 組卵巢癌A2780 細(xì)胞中Syk 的表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

F

=294.889，

P

＜0.001），miR-374a 組（0.07±0.01）低于miR-NC 組（0.26±0.02）（

P

＜0.05），anti-miR-374a組（0.63±0.06）高于anti-miR-NC組（0.25±0.02）（

P

＜0.05），見圖4。

圖4 過表達(dá)miR-374a或抑制miR-374a表達(dá)對(duì)Syk蛋白表達(dá)的影響

2.4 抑制Syk 表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-374a 表達(dá)對(duì)細(xì)胞A2780 放射敏感性的影響

相較于anti-miR-374a+si-NC 組，anti-miR-374a+si-Syk 組卵巢癌A2780 細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)升高（

P

＜0.05），增敏比明顯降低，見表5，6。

表5 抑制Syk表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-374a表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞A2780存活分?jǐn)?shù)的影響/±s

表6 細(xì)胞放射增敏比單擊多靶模型參數(shù)

2.5 抑制Syk 表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-374a 表達(dá)對(duì)細(xì)胞A2780 生物學(xué)行為的影響

anti-miR-374a+si-Syk組卵巢癌A2780 細(xì)胞活力、cyclin D1 和MMP-2 蛋白表達(dá)、遷移與侵襲數(shù)高于anti-miR-374a+si-NC 組（

P

＜0.05），P21 和E-cadherin 蛋白表達(dá)低于anti-miR-374a+si-NC組（

P

＜0.05），見圖5、表7、表8。

表7 抑制Syk表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-374a表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞A2780增殖的影響/±s

表8 抑制Syk表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-374a表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞A2780遷移、侵襲的影響/±s

圖5 抑制Syk表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-374a表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞A2780增殖、遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

3 討論

卵巢癌病人在治療期間易出現(xiàn)耐藥、轉(zhuǎn)移等導(dǎo)致病人預(yù)后不良，但關(guān)于卵巢癌發(fā)病機(jī)制仍需深入研究。卵巢癌晚期病人主要采用放療進(jìn)行治療，其主要通過抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞而發(fā)揮作用，但治療過程中病人常出現(xiàn)輻射敏感等現(xiàn)象，進(jìn)一步研究顯示miRNA 表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞生長及治療密切相關(guān)。但miRNA 在卵巢癌細(xì)胞放射抵抗中的調(diào)控作用尚未完全闡明。

miR-374a 在非小細(xì)胞肺癌病人血清中的表達(dá)水平升高，并可能成為臨床診斷非小細(xì)胞肺癌的輔助指標(biāo)。研究表明miR-374a 高表達(dá)與宮頸癌病人淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征有關(guān)。miR-374a-5p可通過靶向SPIN1而降低食管鱗狀細(xì)胞癌對(duì)放療的敏感性。本研究結(jié)果顯示miR-374a 在卵巢癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，抑制miR-374a 表達(dá)可提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)放射的敏感性。進(jìn)一步研究顯示抑制miR-374a 表達(dá)可降低卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，通過蛋白質(zhì)印跡法證實(shí)抑制miR-374a 表達(dá)可促進(jìn)P21、E-cadherin 表達(dá)，抑制cyclin D1、MMP-2 表達(dá)，另有研究報(bào)道指出cyclin D1 可通過與CDK 結(jié)合形成復(fù)合物進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖及分裂導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，P21 可抑制cyclin D1 與CDK 結(jié)合形成復(fù)合物從而抑制腫瘤細(xì)胞惡性進(jìn)展。研究表明MMP-2 在卵巢癌組織中高表達(dá)并可促進(jìn)細(xì)胞遷移及侵襲，E-cadherin 表達(dá)減少可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤擴(kuò)散。本研究證實(shí)抑制miR-374a 表達(dá)可減弱卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。

Syk基因可調(diào)控B淋巴細(xì)胞的多種生物學(xué)過程，研究表明Syk 基因在結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤中呈低表達(dá)，并可在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌基因作用。Syk可改變膠質(zhì)瘤微環(huán)境，影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及遷移。本研究試圖分析miR-374a 與Syk 在卵巢癌細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移及放射敏感性中的作用關(guān)系，結(jié)果表明miR-374a 可負(fù)向調(diào)控Syk的表達(dá)，且聯(lián)合抑制miR-374a和Syk表達(dá)后，卵巢癌細(xì)胞活力增強(qiáng)，遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)增多，提示miR-374a 通過靶向Syk 來抑制卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為，增強(qiáng)細(xì)胞放射敏感性。

綜上，miR-374a 表達(dá)水平降低可增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞放射敏感性，其作用機(jī)制可能是通過上調(diào)Syk 表達(dá)降低卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力而實(shí)現(xiàn)，可為卵巢癌放射治療提供新方向。

（本文圖1見插圖12-3）