孫帥玲，馬曉北

(中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所,北京 100700)

高脂血癥是由體內(nèi)膽固醇及甘油三酯升高引起的全身性慢性代謝性疾病。流行病學(xué)調(diào)查顯示我國高脂血癥的發(fā)病率逐年上升，且呈年輕化趨勢，近年來隨著生活節(jié)奏加快，暴飲暴食、嗜酒、運動減少、社會壓力大、精神高度緊張等危險因素導(dǎo)致高脂血癥發(fā)病率居高不下[1]。血脂升高可引起血液黏稠度增加，損傷血管內(nèi)皮，產(chǎn)生炎癥因子,刺激機體產(chǎn)生C-反應(yīng)蛋白，最終導(dǎo)致動脈粥樣硬化。研究發(fā)現(xiàn)高脂血癥是動脈粥樣硬化、心腦血管疾病、肥胖、脂肪肝等疾病的重要危險因素之一[2]。臨床上西醫(yī)治療常選用他汀類藥物、貝特類藥物等降脂藥物，但服藥周期長，且不良反應(yīng)較多[3-5]。茵陳蒿湯由茵陳蒿、大黃、梔子三味中藥組成，臨床中常用于治療肝膽疾病、高血脂癥、Ⅱ型糖尿病、急性胰腺炎、癌癥等。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建茵陳蒿湯治療高脂血癥的分子作用網(wǎng)絡(luò)，通過分析分子間相互作用，系統(tǒng)闡釋茵陳蒿湯治療高脂血癥的作用機制，為高血脂癥臨床用藥提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究資料 本研究所采用的平臺及數(shù)據(jù)庫主要有中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(Traditional Chinese medicine systems pharmacology database，TCMSP)、Genecards數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、Uniprot數(shù)據(jù)庫、String數(shù)據(jù)庫以及Metascape平臺和Cytoscape 3.7.1軟件。

1.2 研究方法

1.2.1 茵陳蒿湯活性成分及蛋白質(zhì)靶點篩選：通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索茵陳、大黃、梔子的活性成分，以口服生物利用度(OB)≥30%以及藥物相似性(DL)≥ 0.18為條件篩選其作用的蛋白質(zhì)靶點，使用Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫規(guī)范靶點名稱。

1.2.2 高脂血癥相關(guān)靶點篩選：以“hypercholesterolemia”“hyperlipidemia”“hypertriglyceridemia”為關(guān)鍵詞檢索TTD數(shù)據(jù)庫、Genecards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫中與高脂血癥相關(guān)的潛在靶點。將在Genecards數(shù)據(jù)庫中篩選的靶點條件設(shè)定Score大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點作為高脂血癥的潛在靶點，將3個疾病數(shù)據(jù)庫中所篩選到的靶點進行合并，刪除重復(fù)值，獲得高脂血癥相關(guān)靶點。

1.2.3 構(gòu)建共同靶點PPI網(wǎng)絡(luò)：將茵陳蒿湯活性成分靶點與高脂血癥靶點進行映射取交集，得到韋恩圖。String數(shù)據(jù)庫的作用在于預(yù)測及分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用[6]。將映射后所得共同靶點導(dǎo)入String 11.0數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)模型，生物種類限定為人，將得到的結(jié)果輸入Cytoscape 3.7.2內(nèi)置工具分析靶點的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，計算其度值(Degree)，篩選核心靶基因。

1.2.4 共同靶點富集分析和通路分析：基因本體論 (Gene ontology，GO)及京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析旨在探究相關(guān)基因主要涉及的分子功能和生物過程[7]。Metascape平臺旨在提供全面的基因列表注釋和分析資源[8]。通過Metascape平臺對茵陳蒿湯-高脂血癥共同靶點進行GO分析以及KEGG分析，根據(jù)結(jié)果繪制柱狀圖。

1.2.5 “茵陳蒿湯成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建：Cytoscape作為一種可視化軟件，能夠直觀分析藥物治療疾病的作用機制[9]。本研究在獲得茵陳蒿湯有效活性成分、共同靶點、通路的基礎(chǔ)上，利用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“成分-靶點-通路”互作網(wǎng)絡(luò)，并進行可視化分析。

2 結(jié) 果

2.1 茵陳蒿湯活性成分及靶點信息 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取茵陳化學(xué)成分53種、大黃化學(xué)成分92種、梔子化學(xué)成分98種，以O(shè)B≥30%、DL≥ 0.18為篩選條件，并去除沒有對應(yīng)靶點的成分后，共得到活性成分17種，其中茵陳活性成分3種、大黃1種、梔子12種，見表1。

表1 茵陳蒿湯主要活性成分基本信息表

2.2 高脂血癥相關(guān)靶點信息 以“hypercholesterolemia”“hyperlipidemia”“hypertriglyceridemia”為關(guān)鍵詞檢索Genecards數(shù)據(jù)庫，獲得高脂血癥靶點分別是1373個、1566個、1612個。根據(jù)經(jīng)驗，Score大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點為高脂血癥的潛在靶點，將上述靶點與在OMIM數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫獲得靶點合并，刪除重復(fù)部分，獲得高脂血癥相關(guān)靶點1469個。

2.3 茵陳蒿湯治療高脂血癥PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將獲取的茵陳蒿湯主要活性成分對應(yīng)的170個作用靶點和1469個高脂血癥靶點進行交集分析，得到交集靶點57個。將其錄入String數(shù)據(jù)庫中，刪除游離蛋白ADH1C，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。將結(jié)果tsv文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件中進行拓?fù)鋮?shù)分析，得到茵陳蒿湯治療高脂血癥的關(guān)鍵核心靶點，然后根據(jù)節(jié)點度值大小進行排列。由Network analyzer工具篩選出該網(wǎng)絡(luò)中Degree值排名前10的靶蛋白，分別是細胞IL-6、AKT1、TNF、VEGFA、TP53、EGF、NOS3、MAPK1、PTGS2、MMP9，圖中顏色越深，圓圈越大，度值越大，節(jié)點越重要(圖1)。

圖1 茵陳蒿湯治療高脂血癥PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析 對茵陳蒿湯藥物與高脂血癥的核心靶點進行GO功能分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析主要涉及細胞對活性氧代謝過程、脂質(zhì)的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、對營養(yǎng)水平的反應(yīng)等生物學(xué)過程(圖2A)；調(diào)節(jié)血脂的功能主要富集在核受體活性、類固醇激素受體、磷酸酶結(jié)合、脂質(zhì)結(jié)合、類固醇結(jié)合、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性等過程(圖2B)；主要參與膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、質(zhì)膜筏等細胞組分的組成(圖2C)。KEGG通路富集分析主要涉及AGER-AGE信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化信號通路、HIF-1信號通路等(圖2D)。

圖2 茵陳蒿湯治療高脂血癥核心靶點GO富集柱狀圖和KEGG通路氣泡圖

2.5 “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 選取排名前20的KEGG代謝通路，將文件導(dǎo)入Cytoscape中，通過CytoScape 3.7.1內(nèi)置的Network Analyzer 繪制茵陳蒿湯成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)(圖3)。黃色圓形節(jié)點為不同藥物的活性成分，菱形為靶點，倒三角為通路，由圖觀察可知，槲皮素(Quercetin)、山奈酚(Kaempferol)等活性成分所對應(yīng)的靶點個數(shù)較多，在通路方面，AGER-AGE信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化信號通路、HIF-1信號通路對應(yīng)得靶點較多，這意味著個數(shù)越多，在調(diào)制高脂血癥方面發(fā)揮的作用越大。

圖3 茵陳蒿湯治療高脂血癥“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

中醫(yī)學(xué)雖無高脂血癥病名，但早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中已有“脂者”“油脂”“脂膜”等記載，《靈樞·衛(wèi)氣失?！罚骸爸?，其血清，氣滑少”這是最早論及脂者的記載。根據(jù)癥狀其病機可歸屬“瘀血”“痰濁”的范疇[10]。瘀血、痰濁是人體津、血代謝失常形成的病理產(chǎn)物，屬于繼發(fā)性因素，影響津液、膏脂的運化與輸布，諸多研究亦證實高脂血癥的病機與瘀血、痰濁相關(guān)[10-11]。津液停聚，痰濕內(nèi)生，脈道閉阻，氣機郁滯，血行不暢而致瘀；血瘀又致液聚痰停，痰濁留脈，脈絡(luò)不暢，痰瘀互結(jié)，引發(fā)高脂血癥，進一步發(fā)展，致脈痹、中風(fēng)等。高脂血癥由于無明顯臨床癥狀、進展緩慢，早期易被忽視[12]。多項研究結(jié)果表明高脂血癥與頸動脈硬化、心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)[13-14]。中醫(yī)認(rèn)為其病因可分為以下幾點：一是飲食失節(jié)，嗜食肥甘厚味，滋生濕熱；二是好逸惡勞，氣機不暢，氣血壅滯；三是情志不舒，氣郁不舒；四是先天稟賦不足，或年老腎精虧虛，導(dǎo)致臟腑功能失調(diào)，氣血津液運行失暢，生脂聚痰，瘀阻脈絡(luò)，發(fā)為本病。該病與肝、脾、腎三臟關(guān)系密切，故治療上應(yīng)調(diào)理肝、脾、腎三臟，同時注重化痰祛瘀。近年來，中藥治療高脂血癥的臨床研究不斷深入，藥理研究結(jié)果顯示其主要通過以下四點發(fā)揮作用：一是抑制外源性脂類和膽酸的吸收；二是抑制脂類物質(zhì)的合成；三是降低血黏度、激活纖溶、抑制凝血減少脂類物質(zhì)在血管內(nèi)皮的沉積；四是通過抗氧化等發(fā)揮降脂作用[15-19]。

茵陳蒿湯方中君以茵陳苦泄下降，清熱利濕；臣以梔子清熱降火，通利三焦，助茵陳引濕熱從小便而去；佐以大黃瀉熱逐瘀，通利大便，導(dǎo)瘀熱從大便而下。Shindoh等[20]研究發(fā)現(xiàn)茵陳中含有的槲皮素、β-谷甾醇、異鼠李素等有效成分具有抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、保肝利膽、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)等作用；大黃中蒽醌類成分含有的大黃酸和大黃素在抗病毒、保肝護腎、保護胰腺、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗腫瘤、減輕腦缺血損傷、保護心血管系統(tǒng)均具有一定的功效[21-22]。梔子主要藥理成分包括黃酮類化合物、萜類化合物、有機酸酯類、揮發(fā)油、多糖以及各種微量元素等[23]，現(xiàn)代藥理研究顯示梔子在調(diào)脂[24]、抗炎[25]、抗氧化[26]等方面具有一定的功效。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯治療高脂血癥的活性成分主要包括槲皮素、β谷甾醇、山奈酚、異鼠李素等。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素的代謝產(chǎn)物通過抑制成熟脂肪細胞中葡萄糖攝取和甘油三酯形成達到降脂效果；槲皮素及其苷類化合物通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)分解、合成、代謝對高脂血癥、肥胖癥等非傳染性慢性病起到防治作用。β-谷甾醇因與膽固醇的結(jié)構(gòu)相似，通過競爭抑制腸道對膽固醇的吸收，抑制酯化酶，促進膽固醇排泄。山奈酚通過下調(diào)SREBPs增加脂質(zhì)代謝，促進ACO和CYP4A1的表達，進而直接上調(diào)肝臟PPAR-α的表達，減少內(nèi)臟脂肪堆積，改善高脂血癥。研究顯示異鼠李素具有保護血管內(nèi)皮細胞、抑制脂肪分化、抑制血管內(nèi)皮細胞增殖、調(diào)節(jié)免疫功能、耐缺氧、抗炎等作用，可以通過下調(diào)3T3-L1脂肪細胞中的PPAR-γ和CEBP-α抑制脂肪生成[27]。

通過蛋白互作分析發(fā)現(xiàn)IL-6、AKT1、TNF、VEGFA、TP53、EGF、NOS3、MAPK1、PTGS2、MMP9等是茵陳蒿湯治療高脂血癥的潛在靶點。其中，IL-6、TNF、VEGFA、PTGS2、MMP9是重要的炎癥因子[27]，同時IL-6、TNF等是促進動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的重要因素。Cavieres等[28]在實驗中發(fā)現(xiàn)IL-6通過反式激活因子-3抑制內(nèi)皮細胞NO和eNOS的水平，損傷內(nèi)皮細胞功能；AKT1參與代謝、胰島素信號傳導(dǎo)、血管生成等多種生物學(xué)過程；VEGFA是調(diào)節(jié)脂肪組織中血管生成的重要因子，TP53通過調(diào)節(jié)基因的表達誘導(dǎo)細胞周期阻滯、凋亡、衰老等過程。由上可知，茵陳蒿湯主要通過參與炎癥因子、脂肪組織的形成與維持、脂肪組織中血管生成等生理過程發(fā)揮其調(diào)治高脂血癥的目的。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯治療高脂血癥的主要通路包括AGER-AGE信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化信號通路、HIF-1信號通路等。AGE-RAGE信號通路能夠介導(dǎo)動脈粥樣硬化、糖尿病、癌癥等多種慢性病變，高水平AGE能激活并參與脂肪儲存、炎癥、氧化應(yīng)激和細胞因子合成等；研究顯示高脂、高糖飲食等不良生活方式可增加、積累AGEs[29]，AGEs與其細胞受體RAGE結(jié)合激活核因子kappa-B，增加炎癥細胞因子的表達和釋放以及產(chǎn)生氧自由基，進而導(dǎo)致細胞功能障礙；HIF-1信號通路通過控制長鏈?；o酶A脫氫酶(包括MCAD、LCAD)，降低活性氧水平及增加脂肪[30]。在高脂血癥向動脈粥樣硬化發(fā)展過程中，流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路也發(fā)揮重要的預(yù)防或抑制作用。血流紊亂產(chǎn)生的低切應(yīng)力和振蕩剪應(yīng)力則可引起動脈粥樣硬化，層流血流產(chǎn)生的流體剪應(yīng)力可以保護血管免受動脈粥樣硬化的損害，RAGE的受體sRAGE通過阻斷血流紊亂引起的RAGE信號通路發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用[31]。茵陳蒿湯可能通過抑制脂肪生成、代謝，促進膽固醇排泄，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、血管重塑等發(fā)揮調(diào)節(jié)血脂作用，預(yù)防動脈粥樣硬化發(fā)生。

綜上所述，中藥通過多組分、多靶點、多途徑發(fā)揮治療疾病的作用。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析茵陳蒿湯治療高脂血癥的作用機制，發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯調(diào)節(jié)高脂血癥的作用機制具有多成分-多靶點-多通路的特性。本研究為茵陳蒿湯治療高脂血癥的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供參考，但由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的局限性，后期將在此基礎(chǔ)進一步篩選予動物或細胞實驗加以驗證，進一步明確茵陳蒿湯治療高脂血癥的主要作用機制。