何 花 董大立

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院護(hù)理部，湖南 長沙 410005)

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)橹饕卣?，并逐漸侵犯軟骨下骨、滑膜等周圍組織的慢性、進(jìn)展性關(guān)節(jié)疾病[1]。對于KOA的治療除了延緩關(guān)節(jié)軟骨退變外，還需要關(guān)注軟骨下骨硬化、囊性變和代償性骨贅形成等異常骨重建的影響[2]。KOA屬中醫(yī)學(xué)“骨痹”“痿痹”等范疇，肝腎虧虛、筋骨失養(yǎng)為痹證之主要病因[3]。早在《內(nèi)經(jīng)》中就提出了“腎藏精-生髓-主骨”理論，即腎虛髓減則骨痹，腎健髓充則骨堅(jiān)[4]?；谥嗅t(yī)學(xué)理論對骨痹的認(rèn)識，并將“治未病”思想引入KOA的治療，以補(bǔ)益肝腎、活血止痹為大法，以減輕臨床癥狀、延緩病情發(fā)展[5]。丹紫康膝沖劑是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院多年治療KOA的經(jīng)驗(yàn)方劑，前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，丹紫康膝沖劑治療KOA可以顯著改善臨床癥狀，有效預(yù)防復(fù)發(fā)，不良反應(yīng)少[6]。由于其作用機(jī)制尚不明確，為其臨床推廣帶來了一定的局限性。本研究擬通過丹紫康膝沖劑干預(yù)KOA大鼠模型，以闡述丹紫康膝沖劑對延緩關(guān)節(jié)軟骨退變和軟骨下骨異常骨重建的作用及可能的分子機(jī)制，為丹紫康膝沖劑的研究和臨床開發(fā)提供可靠的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2個(gè)月齡SPF級SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量200～220 g，購自湖南省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2016-0002。飼養(yǎng)溫度22～25 ℃，濕度45%～65%，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水，飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級。實(shí)驗(yàn)方案得到湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑 丹紫康膝沖劑由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科制成成品提供，藥物組成：紫河車、丹參、熟地黃、懷牛膝、補(bǔ)骨脂、巴戟天、桑寄生、土鱉蟲、血竭、獨(dú)活、乳香、白芍，以上藥物由藥劑科進(jìn)行煎煮并濃縮至原藥濃度3 g/mL，使用時(shí)溶于蒸餾水，根據(jù)需要配制成相應(yīng)濃度懸混液。雙氯芬酸鈉腸溶片(廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國藥準(zhǔn)字H44024989)；硫酸慶大霉素注射液(華中藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H42021503)。試劑：TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒(美國Roche公司)；兔抗鼠Ⅱ型膠原多克隆抗體、兩步法免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；Ⅱ型膠原C端肽(CTXⅡ)、Ⅱ型膠原C前肽(CPⅡ)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、IL-18、腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸劑(ELISA)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；兔抗鼠B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)多克隆抗體和鼠抗人Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)單克隆抗體(美國CST公司)；兔抗鼠基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)多克隆抗體、兔抗鼠MMP-13多克隆抗體、兔抗鼠骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(BMP-7)多克隆抗體(英國Abcam公司)；蘇木精-伊紅(HE)染色液(上海譜振生物科技有限公司)；番紅-O-固綠植物組織染色液(北京雷根生物技術(shù)有限公司)；水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Varioskan LUX型多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Mini-PROTEAN Tetra Cell型小型垂直蛋白電泳儀(美國Bio-Rad公司)；Micro-computed tomography(Micro-CT)系統(tǒng)(比利時(shí)SkyScan公司)；Mimics V2.1.2三維重建系統(tǒng)(比利時(shí)Materialise公司)；JY-DST671實(shí)驗(yàn)動(dòng)物電子秤(北京金洋萬達(dá)科技有限公司)；TGL-18R型臺式冷凍離心機(jī)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)；XSP-C204型光學(xué)顯微鏡(重慶光電儀器有限公司)；熒光顯微鏡(上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司)；實(shí)驗(yàn)室冰箱(北京福意電器有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 KOA大鼠模型制備 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，取10只大鼠設(shè)為空白組，不做任何處理，其余30只大鼠復(fù)制KOA模型。根據(jù)Hulth法[7]建立KOA模型：腹腔注射10%水合氯醛將大鼠麻醉，固定在手術(shù)操作臺上，沿右側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)入路，充分暴露關(guān)節(jié)腔，切斷前交叉韌帶，經(jīng)“前抽屜試驗(yàn)”驗(yàn)證呈陽性，則造模成功?？p合傷口。術(shù)畢，正常飼養(yǎng)，在傷口處涂抹硫酸慶大霉素注射液1周，以防傷口感染。術(shù)后大鼠置于3～10 ℃環(huán)境中，相對濕度保持在70%以上，每日活動(dòng)6 h以上，于造模成功后4周，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、雙氯芬酸鈉組、丹紫康膝沖劑組，每組10只。

1.4.2 給藥方法 丹紫康膝沖劑組予1.67 g/kg丹紫康膝沖劑灌胃，雙氯芬酸鈉組予5 mg/kg雙氯芬酸鈉灌胃，空白組、模型組均予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃，每日灌胃1次，連續(xù)28 d。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)觀察(HE染色)及病理學(xué)退變指標(biāo) 大鼠用10%水合氯醛麻醉，剝?nèi)∮覀?cè)脛骨平臺軟骨組織，常規(guī)石蠟包埋。取石蠟包埋組織切片。分別利用二甲苯和不同濃度的乙醇溶液進(jìn)行水化，HE染液染色，中性樹脂封片后，200倍鏡下觀察大鼠軟骨組織。關(guān)節(jié)軟骨損傷的嚴(yán)重程度采用改良的國際骨關(guān)節(jié)炎研究會(OARSI)評分系統(tǒng)[8]進(jìn)行評估，具體評估病變軟骨基質(zhì)丟失寬度和軟骨退變最顯著處的寬度。

1.5.2 膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)觀察(番紅-O-固綠組織染色) 石蠟包埋組織切片方法同1.5.1。經(jīng)新鮮配置的Weigert染液染色、在固綠染色液內(nèi)浸染、加入番紅O染色，中性樹脂封片后，200倍鏡下觀察大鼠軟骨組織。

1.5.3 膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)檢測 采用末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的DIG-dUPT切口末端標(biāo)記法(TUNEL)。石蠟包埋組織切片方法同1.5.1。滴加蛋白酶K工作液進(jìn)行組織修復(fù)，破膜工作液破膜，去離子水洗滌3次，置于37 ℃濕盒中，依次用熒光標(biāo)記的TUNEL反應(yīng)液染色1 h，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復(fù)染核10 min，切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。切片于400倍熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。凋亡指數(shù)=陽性細(xì)胞數(shù)/視野下總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5.4 血清IL-1β、IL-18、TNF-α、CTXⅡ、CPⅡ水平檢測 大鼠末次給藥24 h后，尾靜脈取血0.5 mL，收集血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?，采用ELISA法檢測。將100 μL的血清加入包被有IL-1β、IL-18、TNF-α、CTXⅡ、CPⅡ抗體的微孔中，室溫孵育1 h，采用酶標(biāo)儀檢測450 nm吸收波長處的吸光光度值，并對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白含量。

1.5.5 膝關(guān)節(jié)軟骨組織Bcl-2、Bax、MMP-3、MMP-13、BMP-7蛋白表達(dá)檢測 采用蛋白免疫印跡法(Western blot)。收集新鮮的膝關(guān)節(jié)軟骨組織5 g，迅速放入預(yù)冷的研缽中搗碎，提取細(xì)胞總蛋白，取20 μg蛋白樣品進(jìn)行20%聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，將一抗按比例稀釋(Bcl-2 1∶2000；Bax 1∶2000；MMP-3 1∶500；MMP-13 1∶500；BMP-7 1∶500；一抗用完后回收)，分別孵育過夜，二抗孵育1 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)曝光后，對蛋白條帶進(jìn)行掃描。

1.5.6 Micro-CT掃描膝關(guān)節(jié)軟骨和各組大鼠脛骨近端軟骨下骨微結(jié)構(gòu)參數(shù) 取右側(cè)脛骨近端關(guān)節(jié)離體標(biāo)本平放置于Micro-CT掃描系統(tǒng)的掃描槽中，沿長軸方向橫向掃描。將X射線源設(shè)置為50 kV電壓和200 μA電流，并用0.5 mm鋁過濾器過濾，掃描旋轉(zhuǎn)角度180°，增量0.5°；體素尺寸固定為8.9 μm。利用CTan軟件從三維圖像上的顯微CT數(shù)據(jù)確定骨區(qū)的形態(tài)計(jì)量指標(biāo)，對骨組織進(jìn)行三維圖像重建和定量分析。包括感興趣區(qū)骨體積(BV)；骨體積分?jǐn)?shù)：骨體積/總體積(BV/TV)；骨小梁平均厚度(Tb.Th)；骨小梁數(shù)量(Tb.N)；體積骨密度(vBMD)；組織骨密度(tBMD)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)脛骨平臺軟骨組織病理學(xué)觀察 見圖1、2。

由圖1可見，經(jīng)HE染色，空白組大鼠軟骨滑膜組織完整，細(xì)胞排列整齊，無炎癥細(xì)胞浸潤和基質(zhì)損傷或蛻變。模型組大鼠軟骨組織表面凸凹不平，軟骨表層變薄，細(xì)胞排列不規(guī)則，此外可見大量炎癥細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，而且深部軟骨細(xì)胞可見明顯細(xì)胞核壓縮，膝關(guān)節(jié)寬度和關(guān)節(jié)退變深度顯著增加。與模型組比較，丹紫康膝沖劑組大鼠軟骨細(xì)胞排列均勻，胞核和胞質(zhì)逐漸恢復(fù)正常。

圖1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)脛骨平臺軟骨組織病理學(xué)觀察(HE，×200)

由圖2可見，經(jīng)番紅-O-固綠染色，空白組大鼠軟骨組織染色均勻，結(jié)構(gòu)清晰。模型組大鼠骨關(guān)節(jié)面不平，軟骨鈣化，膠原纖維增生，軟骨細(xì)胞外基質(zhì)經(jīng)番紅O染色變淺，染色不均一，而且軟骨陷窩結(jié)構(gòu)擴(kuò)張。與模型組比較，丹紫康膝沖劑組大鼠軟骨組織番紅O染色稍淡染，潮線逐漸清晰，細(xì)胞排列逐漸均勻。

圖2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)脛骨平臺軟骨組織病理學(xué)觀察(番紅-O-固綠，×200)

2.2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)退變指標(biāo)比較 見表1。

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)退變指標(biāo)比較

由表1可見，與空白組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)丟失寬度、OARSI評分、軟骨退變總寬度、軟骨退變最顯著處的寬度均增加(P<0.05)；與模型組比較，雙氯芬酸鈉組、丹紫康膝沖劑組大鼠上述指標(biāo)則均減少(P<0.05)；雙氯芬酸鈉組與丹紫康膝沖劑組大鼠上述指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 見圖3。

由圖3可見，與空白組比較，模型組大鼠軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)升高(P<0.05)；與模型組比較，雙氯芬酸鈉組、丹紫康膝沖劑組大鼠軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)降低(P<0.05)；與雙氯芬酸鈉組比較，丹紫康膝沖劑組軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)降低(P<0.05)。

圖3 各組大鼠軟骨細(xì)胞凋亡情況(TUNEL，×400)

2.4 各組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、CTXⅡ、CPⅡ水平比較 見表2。

由表2可見，與空白組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、CTXⅡ水平均升高，CPⅡ水平降低(P<0.05)；與模型組比較，雙氯芬酸鈉組、丹紫康膝沖劑組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、CTXⅡ水平均降低(P<0.05)，CPⅡ水平升高(P<0.05)；與雙氯芬酸鈉組比較，丹紫康膝沖劑組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、CPⅡ水平均升高(P<0.05)，CTXⅡ水平降低(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、CTXⅡ、CPⅡ水平比較

2.5 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織Bcl-2、Bax、MMP-3、MMP-13、BMP-7蛋白表達(dá)比較 見表3、圖4。

表3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織Bcl-2、Bax、MMP-3、MMP-13、BMP-7蛋白表達(dá)比較

圖4 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織Bcl-2、Bax、MMP-3、MMP-13、BMP-7蛋白表達(dá)情況

由表3、圖4可見，經(jīng)Western blot法檢測，與空白組比較，模型組大鼠軟骨組織Bax、MMP-3、MMP-13蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)，Bcl-2、BMP-7蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)；與模型組比較，雙氯芬酸鈉組、丹紫康膝沖劑組大鼠軟骨組織Bax、MMP-3、MMP-13蛋白表達(dá)量均降低(P<0.05)，Bcl-2、BMP-7蛋白表達(dá)量均升高(P<0.05)；與雙氯芬酸鈉組比較，丹紫康膝沖劑組大鼠軟骨組織Bcl-2、Bax、MMP-3蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)，BMP-7蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)，MMP-13蛋白表達(dá)量無明顯變化(P>0.05)。

2.6 Micro-CT掃描關(guān)節(jié)軟骨和各組大鼠脛骨近端軟骨下骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)比較 見表4、圖5。

圖5 各組大鼠右膝關(guān)節(jié)股骨冠狀面和橫斷面Micro-CT掃描

表4 各組大鼠脛骨近端軟骨下骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)比較

由表4可見，與空白組比較，模型組大鼠脛骨近端軟骨下骨BV/TV、Tb.Th、Tb.N、vBMD均降低(P<0.05)；與模型組比較，雙氯芬酸鈉組、丹紫康膝沖劑組大鼠脛骨近端軟骨下骨BV/TV、Tb.Th、Tb.N、vBMD均升高(P<0.05)；與雙氯芬酸鈉組比較，丹紫康膝沖劑組大鼠脛骨近端軟骨下骨BV/TV、Tb.Th、Tb.N、vBMD均升高(P<0.05)。各組大鼠脛骨近端軟骨下骨tBMD組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

由圖5可見，經(jīng)Micro-CT掃描，模型組大鼠脛骨近端軟骨表層可見大量基質(zhì)破損或丟失，軟骨下骨骨小梁數(shù)量減少、排列紊亂并出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象。與模型組比較，丹紫康膝沖劑組大鼠軟骨表層基質(zhì)雖然也存在破損，但是最深至淺層或中層，尚未累及軟骨下骨；軟骨下骨骨小梁排列整齊，關(guān)節(jié)邊緣未見骨贅形成。

3 討論

目前，KOA的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，一般認(rèn)為KOA是力學(xué)和生物學(xué)因素共同作用下涉及軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、軟骨下骨結(jié)構(gòu)和功能失衡的一種進(jìn)行性關(guān)節(jié)疾病[9]。近年來，越來越多的基礎(chǔ)研究證實(shí)軟骨下骨重塑導(dǎo)致骨密度增高、硬化，進(jìn)而導(dǎo)致骨小梁順應(yīng)不正常應(yīng)力的局部數(shù)量增加、變厚，軟骨下骨吸收應(yīng)力震蕩作用減弱，從而加重關(guān)節(jié)軟骨退變的過程[10]，因此延緩軟骨組織退變和軟骨下骨異常骨重塑已成為治療KOA的重要的方法。

“腎主骨，肝主筋”，KOA發(fā)病與肝腎虧虛，風(fēng)、寒、濕及瘀血客于局部有關(guān)。因此，從補(bǔ)益肝腎角度論治KOA不僅符合中醫(yī)理論，而且符合現(xiàn)代病理機(jī)制，目前已成為眾多學(xué)者臨床及實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn)內(nèi)容之一[11]。丹紫康膝湯為我院治療KOA的經(jīng)驗(yàn)方，具有補(bǔ)肝益腎、活血通絡(luò)、柔肝止痛之功效[12]。方中紫河車總攬補(bǔ)益大效，在補(bǔ)益腎精的同時(shí)，又能補(bǔ)氣生血；丹參行血祛瘀，通絡(luò)止痛；懷牛膝補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋壯骨，還能行血通經(jīng)；巴戟天補(bǔ)腎陽，祛風(fēng)濕；熟地黃養(yǎng)陰益腎，封髓治虛；補(bǔ)骨脂壯腎充陽；土鱉蟲續(xù)筋接骨；乳香行氣止痛，能夠加強(qiáng)丹參的效用；桑寄生、獨(dú)活相須為用，祛風(fēng)除濕，強(qiáng)筋健骨；血竭配伍白芍，活血定痛，化瘀通絡(luò)，斂陰養(yǎng)血。諸藥合用，標(biāo)本兼顧，共奏補(bǔ)腎益氣、強(qiáng)筋壯骨、活血祛瘀、通絡(luò)止痛之功?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎類中藥有明顯延緩KOA的軟骨退變的作用，并能促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖[13]；牛膝含有甾酮類(β-谷甾醇、豆甾醇)、多糖類等化合物，具有抗炎、增強(qiáng)免疫力、抗骨質(zhì)疏松等作用[14]。丹紫康膝湯經(jīng)我院數(shù)十年臨床驗(yàn)證已取得較好的療效，但因湯劑存在加工復(fù)雜、不方便攜帶等不足，我院近年來一直致力該方劑型方面的研究，以沖劑作為劑型已有較深入研究，相關(guān)研究表明丹紫康膝沖劑能提高大鼠膝關(guān)節(jié)端粒酶活性，從而延緩大鼠KOA的進(jìn)一步發(fā)展，其作用機(jī)制與磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制蛋白激酶β/核轉(zhuǎn)錄因子κB(IKKβ/NF-κB)信號傳導(dǎo)通路有關(guān)[15]。

前期研究顯示，丹紫康膝沖劑通過抑制由一氧化氮(NO)介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制KOA模型大鼠關(guān)節(jié)軟骨退變[16]。Bcl-2蛋白是Bcl-2家族中抗凋亡蛋白的代表，Bax是促細(xì)胞凋亡蛋白的代表。本研究結(jié)果顯示，通過對KOA大鼠模型進(jìn)行藥物干預(yù)，經(jīng)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理觀察和蛋白表達(dá)檢測，與模型組比較，丹紫康膝沖劑組大鼠軟骨組織Bax蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)。提示丹紫康膝沖劑可以顯著改善大鼠軟骨組織的損傷狀態(tài)和軟骨細(xì)胞凋亡。

IL-1β、IL-18、TNF-α是KOA發(fā)生、進(jìn)展過程中重要的炎癥細(xì)胞因子，與軟骨下骨異常骨重建亦密切相關(guān)。Ⅱ型膠原是評價(jià)骨關(guān)節(jié)炎的重要標(biāo)志物，CTXⅡ和CPⅡ作為Ⅱ型膠原降解、合成標(biāo)志物，其變化可反映軟骨損傷程度[17]。有研究顯示，與非硬化區(qū)的成骨細(xì)胞相比，KOA大鼠模型硬化區(qū)軟骨下骨成骨細(xì)胞的MMP-3、MMP-13表達(dá)量顯著上調(diào)，從而促進(jìn)IL-1β、IL-18、TNF-α等炎癥細(xì)胞因子的合成和分泌[18]。MMP-3、MMP-13均是促使Ⅱ型膠原纖維降解重要的誘導(dǎo)因子，MMPs蛋白表達(dá)失衡可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞外基質(zhì)過度降解，從而對軟骨造成進(jìn)行性破壞[19-20]。BMP-7能夠調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞代謝，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，維持軟骨組織形態(tài)[21]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，丹紫康膝沖劑組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、CTXⅡ水平降低，CPⅡ水平升高(P<0.05)，軟骨組織MMP-3、MMP-13蛋白表達(dá)量降低，BMP-7蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)。說明丹紫康膝沖劑在治療大鼠KOA過程中，具有降低炎癥細(xì)胞因子分泌、抑制Ⅱ型膠原的降解并促進(jìn)其合成、減輕關(guān)節(jié)軟骨破壞和降低MMPs表達(dá)的作用。

除了軟骨下骨分子表型受到影響以外，軟骨下骨的結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)性能與KOA的進(jìn)展也密切相關(guān)。作為關(guān)節(jié)最重要的應(yīng)力傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)之一，軟骨下骨通過形變吸收應(yīng)力和緩沖震蕩保護(hù)關(guān)節(jié)功能[22]。但是反復(fù)脈沖式負(fù)重可引起軟骨下骨骨小梁微骨折，因此在KOA發(fā)病早期，骨小梁多出現(xiàn)疏離、斷裂現(xiàn)象，導(dǎo)致軟骨下骨骨密度降低而軟骨下骨骨板處增厚，從而大大減弱了軟骨下骨緩沖應(yīng)力能力，反過來可進(jìn)一步加重軟骨退變。在本研究中我們通過Micro-CT成像技術(shù)證實(shí)，與空白組比較，模型組大鼠軟骨下骨骨密度降低(P<0.05)，脛骨近端軟骨表層可見大量基質(zhì)破損或丟失，軟骨下骨骨小梁數(shù)量減少、排列紊亂并出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象；與模型組大鼠比較，丹紫康膝沖劑組大鼠脛骨BV、BV/TV、Tb.Th、Tb.N、vBMD均升高(P<0.05)；與雙氯芬酸鈉組比較，丹紫康膝沖劑組大鼠脛骨BV、BV/TV、Tb.Th、Tb.N、vBMD均升高(P<0.05)。說明丹紫康膝沖劑不僅可以改善KOA發(fā)病早期階段關(guān)節(jié)軟骨下骨生物學(xué)微損傷，還可以調(diào)節(jié)其生物力學(xué)特性，從而有效阻止KOA進(jìn)展過程中軟骨下骨異常骨重建和微結(jié)構(gòu)改變的可能性。

綜上所述，丹紫康膝沖劑不僅能有效降低炎癥細(xì)胞因子水平和MMPs表達(dá)，減輕軟骨組織病理性損傷，同時(shí)也可以有效地改善KOA早期軟骨下骨生物力學(xué)性能和微結(jié)構(gòu)改變，從而延緩KOA大鼠模型軟骨組織進(jìn)行性退變和軟骨下骨異常骨重塑的發(fā)生。丹紫康膝沖劑將湯劑改良成沖劑，更加便于服用。但丹紫康膝沖劑組方用藥較多，其有效成分及具體作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)探索證實(shí)。