楊曉藝，鹿錦浩，王聰，呂紹芝，林海東，宋希云，裴玉賀

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 山東青島 266109)

NAC轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中常見的轉(zhuǎn)錄因子家族[1]，是由矮牽牛(PetuniahybridaVilm)的NAM基因、擬南芥(Arabidopsisthaliana)的ATAF1/2基因和CUC1/2基因的首字母縮寫命名[2]。保守的NAC結(jié)構(gòu)域存在于NAC蛋白的N端，按保守程度分為A-E 5個亞結(jié)構(gòu)域，A、C、D高度保守，B、E相對可變，長度在150個氨基酸左右，可以與DNA或蛋白質(zhì)結(jié)合[3]。在NAC蛋白的C端，則存在高度可變的轉(zhuǎn)錄激活域或抑制域，這類結(jié)構(gòu)內(nèi)含有大量的脯氨酸、蘇氨酸、絲氨酸等氨基酸，可以控制轉(zhuǎn)錄過程[4]。

目前，在玉米、小麥和擬南芥等物種中發(fā)現(xiàn)了許多NAC轉(zhuǎn)錄因子，其中玉米中發(fā)現(xiàn)的NAC轉(zhuǎn)錄因子超130種。前人研究發(fā)現(xiàn)NAC類轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控玉米的葉片發(fā)育、花藥開裂、逆境生理等，從而影響玉米產(chǎn)量[5-7]。如ZmNAC1可以受外界干旱、ABA等非生物條件誘導(dǎo)提高玉米的抗旱能力[8]；ZmNAM調(diào)控玉米根部的生長發(fā)育[9]；ZmSNAC1激活脅迫相關(guān)基因的表達(dá)并引起代謝產(chǎn)物積累，從而提高植物對非生物脅迫的抗性[10]。玉米作為重要的糧食作物，研究NAC轉(zhuǎn)錄因子對玉米非生物脅迫的響應(yīng)機(jī)制，為培育高產(chǎn)高抗的玉米品種奠定基礎(chǔ)。

本研究從抗性玉米自交系‘遼3162’中克隆出NAC轉(zhuǎn)錄因子基因NAM-2，通過對NAM-2蛋白的理化性質(zhì)、空間結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系的分析，預(yù)測該基因可能具有的功能。利用NaCl和PEG 6000模擬鹽和干旱脅迫，探索非生物脅迫下該基因的表達(dá)特性，為NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料的處理及取樣

取大小均勻、顆粒飽滿的玉米自交系‘遼3162’種子種植在發(fā)芽盒中，培養(yǎng)條件設(shè)置為(25±2) ℃，16 h光照/8 h黑暗，相對濕度70%，培養(yǎng)至三葉一心時用濃度為250 mmol/L的NaCl溶液和20% PEG 6000溶液澆灌分別進(jìn)行鹽和干旱脅迫處理，在處理0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h后，收集玉米幼嫩的根、莖、葉組織，放置在-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2 RNA的提取及cDNA的合成

將超低溫凍存的玉米組織樣品充分研磨成粉末，使用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit[寶生物工程(大連)有限公司, 大連]提取樣品的 RNA。用Nanodrop 2000超微量分光光度計(美國賽默飛世爾，美國) 和1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度、純度和質(zhì)量。用HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司，南京)進(jìn)行cDNA的合成。

1.3 NAM-2基因的克隆

根據(jù)NAM-2基因的核酸序列，用Primer premier 5軟件設(shè)計用于該基因克隆的特異性引物(表1)。以得到的 cDNA 為模板，TotalNAM-2-F/TotalNAM-2-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳對目的條帶進(jìn)行切膠純化回收(南京諾唯贊生物科技有限公司, 南京)。將目的片段與pMD19-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，通過PCR對菌落篩選陽性克隆，并進(jìn)行測序驗證。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 實時熒光定量PCR

通過檢索獲得玉米NAM-2基因序列，設(shè)計cDNA快速擴(kuò)增的上下游引物(如表1所示)，用ChamQTM Universal SYBR?qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司，南京)在熒光定量QuantStudio3 PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，美國)上進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。

1.5 玉米NAM-2基因蛋白性質(zhì)分析

利用ProtParam在線工具對NAM-2蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，使用Protscale對親疏水性進(jìn)一步分析。利用NetPhos 3.1和NetNGlyc 1.0分析蛋白的磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)分析。用SingalP 4.0和TMHMM 2.0軟件進(jìn)行信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測。使用NCBI在線分析工具CD Search分析蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。使用PSIPRED、SOPMA、Phyre 2對蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。通過在線啟動子順式作用元件預(yù)測工具PlantCARE對NAM-2基因可能存在的啟動子順式作用元件進(jìn)行分析。利用 NCBI 中的 BLASTN，將此蛋白與其他植物NAC轉(zhuǎn)錄因子的蛋白進(jìn)行序列比對，分析其序列的同源性。采用 DNAMAN 6.0 進(jìn)行多序列比對，通過MEGA 6.0構(gòu)建蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用2-ΔΔCt方法[11]計算NAM-2基因在根、莖、葉中的相對表達(dá)量和脅迫處理0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h后的相對表達(dá)量。利用 SPSS16.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，處理數(shù)據(jù)，分析差異顯著性；使用Excel 2010繪制柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 NAM-2基因的克隆

根據(jù)基因序列設(shè)計全長引物，以cDNA為模板對NAM-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從玉米自交系‘遼3162’中擴(kuò)增出一條長度為1 122 bp的基因序列(圖1)，根據(jù)ORF finder可知該基因編碼373個氨基酸。

M為Marker；1-2為擴(kuò)增產(chǎn)物。M: Marker; 1-2: The amplification products.圖1 NAM-2基因的克隆Fig. 1 Cloning of NAM-2 gene

2.2 NAM-2基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 NAM-2蛋白的理化性質(zhì)分析

用在線工具ProtParam分析NAM-2蛋白理化性質(zhì)，結(jié)果(表2)顯示，玉米NAM-2蛋白分子式為C1776H2725N523O532S21，相對分子質(zhì)量為 40.59 kDa，等電點(diǎn)為 8.70，說明玉米NAM-2蛋白是一個弱堿性蛋白質(zhì)。NAM-2蛋白內(nèi)包含20種常見氨基酸，其中含量最高的氨基酸為丙氨酸(Ala)，占總量的13.1%，其次為脯氨酸(Pro)和甘氨酸(Gly)，含量分別為8.6%和8.0%，含量最低的為半胱氨酸(Cys)和色氨酸(Trp)，兩種氨基酸各占1.3 %。玉米NAM-2蛋白的平均親水值為-0.573，說明玉米NAM-2蛋白應(yīng)該屬于親水性蛋白。利用在線軟件Protscale分析NAM-2蛋白的親/疏水性，發(fā)現(xiàn)NAM-2蛋白N端含有疏水頭部，C 端為親水頭部，中間氨基酸多數(shù)表現(xiàn)為親水性，少數(shù)表現(xiàn)為疏水性，其中以A261殘基親水性最強(qiáng)，親水值為-2.956，A42殘基疏水性最強(qiáng)，親水值為2.056。 整體上看來，峰值分布在-1以下的氨基酸明顯多于1以上的氨基酸，這個結(jié)果也進(jìn)一步證明玉米NAM-2蛋白為親水性蛋白。

表2 NAM-2蛋白理化性質(zhì)分析Table 2 Analysis of physical and chemical properties of NAM-2 protein

2.2.2 NAM-2蛋白的修飾位點(diǎn)、結(jié)構(gòu)域、信號肽預(yù)測及亞細(xì)胞定位

利用在線工具NetPhos3.1分析(圖2A)，發(fā)現(xiàn)NAM-2蛋白存在35個磷酸化位點(diǎn)，其中包括23個絲氨酸位點(diǎn)、7個蘇氨酸位點(diǎn)和5個酪氨酸位點(diǎn)，可以與磷酸基團(tuán)結(jié)合，傳遞磷酸基團(tuán)。利用在線工具NetNGlyc 1.0進(jìn)行糖基化位點(diǎn)分析(圖2B)，發(fā)現(xiàn)NAM-2蛋白存在2個潛在的糖基化修飾位點(diǎn)，分別在A154和A339。使用在線軟件SignalP4.1和TMHMM 2.0對玉米NAM-2蛋白的信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，玉米NAM-2蛋白并不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，也未發(fā)現(xiàn)有信號肽，并且不存在剪切位點(diǎn)。因此可推測，玉米NAM-2蛋白為非分泌型蛋白，沒有進(jìn)行跨膜運(yùn)輸，直接在細(xì)胞內(nèi)起作用。利用在線分析軟件CD Search和InterPro對NAM-2蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測和檢索，發(fā)現(xiàn)這段蛋白中含有一個典型的NAM保守結(jié)構(gòu)域(圖2C)，位于蛋白N端，屬于NAC家族轉(zhuǎn)錄因子，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，調(diào)控胚的形成和器官分離過程中莖尖分生組織的形成等[12]。利用lncLocator對NAM-2蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明，玉米NAM-2蛋白最有可能定位在細(xì)胞核中。

A. 磷酸位點(diǎn)預(yù)測； B. 糖基化位點(diǎn)預(yù)測；C. 保守結(jié)構(gòu)域分析A. Prediction of phosphate site; B. Prediction of glycosylation site; C. Conserved domain analysis圖2 NAM-2蛋白磷酸位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)預(yù)測和保守結(jié)構(gòu)域分析Fig. 2 Phosphate site and glycosylation site prediction, conserved domain analysis of NAM-2 protein

2.2.3 NAM-2蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用在線軟件PSIPRED和SOPMA對玉米NAM-2蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，NAM-2蛋白的氨基酸殘基組成以58.18%的無規(guī)則卷曲為主，另外還還伴有25.74%的α-螺旋、11.26%的延伸鏈和4.83%的β-折疊。使用同源建模軟件Phyre2對NAM-2蛋白的3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬，結(jié)果顯示相似度最高的模型為c3ulxA，相似度為99.9%，然后利用在線工具SWISS-MODEL對NAM-2蛋白373個氨基酸進(jìn)行3D建模，模板覆蓋率為64.81%。

2.2.4 NAM-2蛋白的進(jìn)化分析

利用 NCBI中的BLASTN，搜索玉米(Zeamays)與狗尾草(Setariaviridis)、小米(Setariaitalica)、柳枝稷(Panicumvirgatum)、高粱(Sorghumbicolor)、結(jié)縷草(zoysiajaponica)、紅樹林草(Aeluropuslagopoides)、粳稻(OryzasativaJaponicaGroup)、短花藥野生稻(Oryzabrachyantha)、花毛竹(Phyllostachysedulis)、慈竹(Bambusaemeiensis)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、野生二粒小麥(Triticumdicoccoides)、普通小麥(Triticumaestivum)等植物的NAM-2基因序列，采用 DNAMAN 6.0進(jìn)行多序列比對，使用MEGA-X構(gòu)建各植物蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹[13]。結(jié)果表明(圖3)，玉米和高粱進(jìn)化關(guān)系最近，而和野生二粒小麥和普通小麥進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖3 玉米NAM-2蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of maize NAM-2 protein

2.3 NAM-2基因的表達(dá)分析

qRT-PCR分析NAM-2在不同組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示(圖4)，玉米NAM-2基因在根、莖、葉3種玉米幼苗組織中均有表達(dá)，但不同部位的表達(dá)量不同，NAM-2在根中的表達(dá)量最低，在葉中的表達(dá)量最高，為根的4.67倍，莖的表達(dá)量次于葉，為根的1.96倍。對模擬鹽脅迫和干旱脅迫處理后的玉米幼葉進(jìn)行實時熒光定量PCR，檢測不同處理時間NAM-2的表達(dá)量變化情況。結(jié)果顯示(圖5)，在鹽脅迫處理3 h出現(xiàn)顯著變化，6 h后NAM-2的表達(dá)量顯著降低；在干旱脅迫處理之后，NAM-2的表達(dá)量在3 h顯著降低，隨后又有所上升，但均顯著低于0 h的表達(dá)量。由此推測，玉米NAM-2基因在抵御干旱和鹽脅迫過程中起重要作用。

圖4 NAM-2基因在不同組織的表達(dá)量Fig. 4 The expression level of NAM-2 gene in different tissues of maize

圖5 NAM-2基因在不同處理時間的表達(dá)量Fig. 5 The expression level of NAM-2 gene in different treatment time注：*表示不同時間處理與0 h 相比在P< 0.05時差異顯著

3 討論

為了研究玉米NAC轉(zhuǎn)錄因子對干旱脅迫和鹽脅迫的響應(yīng)，本研究克隆出NAC家族成員NAM-2，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄因子為堿性蛋白、親水性蛋白、非分泌蛋白，這與大豆、水稻、蘋果中NAC轉(zhuǎn)錄因子的分析結(jié)果一致[14-15]。NAM-2轉(zhuǎn)錄因子N端含有一個典型的NAM保守結(jié)構(gòu)域，有研究表明此類保守結(jié)構(gòu)域可以與DNA結(jié)合[3]。

利用qRT-PCR分析該基因在不同組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NAM-2基因的表達(dá)具有組織特異性，在葉中的表達(dá)量最高，在根中最低。前人的研究表明，小麥的TaNAC-B072基因在幼根中表達(dá)量最高[16]；油菜的BnNAC5基因在莖中表達(dá)量最高[17]；番茄的SlNAC3基因在根、花和果實中表達(dá)量比其他部位高[18]；轉(zhuǎn)基因煙草中的棉花GhSNAC3基因在根部表達(dá)量最高，在莖葉中表達(dá)微量[19]。這意味著不同組織中NAC基因表達(dá)情況也不同，證明NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的不同成員可能在不同組織中發(fā)揮作用。

研究發(fā)現(xiàn)，鹽和干旱脅迫后，玉米幼苗中NAM-2基因的表達(dá)顯著降低，鹽脅迫處理使NAM-2基因的表達(dá)量降低至初始量的1/5，干旱脅迫處理使NAM-2基因的表達(dá)量降低至初始量的2/5。在以往的研究中，發(fā)現(xiàn)多種NAC基因與植物中的非生物脅迫有關(guān)。例如，干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因水稻的TaNAC67基因會調(diào)節(jié)糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高了植物的耐旱性[20]；干旱脅迫也導(dǎo)致水稻ONAC022基因的表達(dá)上調(diào)，從而提高了水稻的耐旱性[21]；在高鹽、干旱和寒冷脅迫下，小麥中TaNAC2基因的過表達(dá)可以提高小麥對這些非生物脅迫的耐受性[22]；蒙古冰草的AmNAC100和AmNAC102-2基因，在干旱處理下表達(dá)上調(diào)，對干旱起正調(diào)控作用[23]。因此可以判斷NAC轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)植物非生物脅迫的過程中起調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié)論

本研究從玉米自交系‘遼3162’中克隆出一個NAM-2基因并對其編碼蛋白進(jìn)行分析，探究此基因在鹽脅迫和干旱脅迫條件下的表達(dá)變化。發(fā)現(xiàn)在非生物脅迫下NAM-2基因表達(dá)均下調(diào)，參與了玉米對非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，其編碼的NAM-2蛋白屬于NAC家族成員。