徐申波，郭振，陳師勇，王鑫，王文琪

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)學(xué)院，山東青島 266109；2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院)

近幾年，我國(guó)蝦蟹集約化養(yǎng)殖發(fā)展迅速，其中凡納濱對(duì)蝦的養(yǎng)殖成為支柱產(chǎn)業(yè)之一。凡納濱對(duì)蝦的養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，疾病頻繁的爆發(fā)，容易導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦大面積死亡。

免疫多糖作為水產(chǎn)養(yǎng)殖的免疫增強(qiáng)劑具有廣闊的應(yīng)用前景[1]，它能夠部分地替代抗生素，減少藥物的大量使用，防止水域環(huán)境的污染，減少對(duì)蝦等養(yǎng)殖生物的抗藥性，目前成為研究的熱點(diǎn)。已陸續(xù)有報(bào)道將蟲草多糖、灰樹花多糖和香菇多糖等作為免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖[2-4]。靈芝多糖作為傳統(tǒng)的中藥材具有較高的藥用價(jià)值[5]，它能夠增強(qiáng)人體免疫力、防止衰老、保護(hù)肝臟，被廣泛應(yīng)用于功能性食品和人類臨床醫(yī)學(xué)。李建軍等[6]比較了靈芝多糖對(duì)小鼠免疫細(xì)胞活力作用，發(fā)現(xiàn)靈芝多糖能夠顯著增強(qiáng)脾T淋巴細(xì)胞的增殖、脾B淋巴細(xì)胞的增殖和分化，抗腫瘤效果明顯。譚崇桂[7]研究了幾種添加劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、血清非特異性免疫及抗病力的影響。然而至今未見將靈芝多糖作為對(duì)蝦免疫增強(qiáng)劑添加到水產(chǎn)飼料中的研究報(bào)道。本研究在對(duì)蝦飼料中添加不同濃度的靈芝多糖，對(duì)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能及免疫酶類活力等不同指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，探索靈芝多糖對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)和免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用凡納濱對(duì)蝦采購于青島市紅島區(qū)東大洋養(yǎng)殖場(chǎng)，體質(zhì)量為(4.5±0.5)g。靈芝多糖發(fā)酵提取液由山東省應(yīng)用真菌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供?；A(chǔ)飼料的配方見表1。

表1 凡納濱對(duì)蝦基礎(chǔ)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)組成

基礎(chǔ)飼料經(jīng)過粉碎機(jī)粉碎后，過60目篩。按質(zhì)量比2∶998取靈芝多糖和基礎(chǔ)飼料，將靈芝多糖溶于水中制成提取液，加入到基礎(chǔ)飼料中混勻，用飼料螺旋擠壓機(jī)制成直徑為1.0 mm的顆粒飼料，放入烘干箱60 ℃烘干，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的靈芝多糖添加飼料，即為多糖Ⅰ組飼料，保存?zhèn)溆谩Ｍ瑯臃椒?，按質(zhì)量比4∶996和6∶994分別制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%(多糖Ⅱ組)和0.6%(多糖Ⅲ組)的靈芝多糖添加飼料。

1.2 試驗(yàn)儀器

BS224S電子天平，德國(guó)sartorius公司；Szx型超凈工作臺(tái)，上海晟力公司；MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋，日本三洋公司；DL-500B超低溫冰箱，山東博科器械有限公司；YSI 550A溶解氧分析儀，美國(guó)YSI儀器儀表公司；dc56飼料螺旋擠壓機(jī)，山東德超機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.3 飼養(yǎng)管理

對(duì)蝦運(yùn)回后置于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院養(yǎng)殖系統(tǒng)缸中暫養(yǎng)1周，水溫保持在21～25 ℃，海水鹽度為4.5～6.0，pH 7.8～8.2，日換水量為1/3～1/2，持續(xù)充氧，每天2～3次換水。暫養(yǎng)結(jié)束后，選取體型勻稱、行為健康的凡納濱對(duì)蝦，隨機(jī)分成4組，每組90尾，分別喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料(對(duì)照組)、多糖Ⅰ組飼料、多糖Ⅱ組飼料、多糖Ⅲ組飼料。每組設(shè)3個(gè)平行組，每30尾為1個(gè)平行組。養(yǎng)殖期間，每天8時(shí)、18時(shí)各投喂相應(yīng)的飼料1次。觀察對(duì)蝦的生活狀態(tài)并記錄對(duì)蝦的死亡數(shù)量。每組水溫、供氧、鹽度等條件保持一致，飼養(yǎng)周期為28 d。

1.4 樣品制備與測(cè)定

1.4.1 生長(zhǎng)性能指標(biāo)

養(yǎng)殖試驗(yàn)開始投喂飼料前，測(cè)量凡納濱對(duì)蝦初均質(zhì)量W1；養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，測(cè)量對(duì)蝦末均質(zhì)量W2，死亡對(duì)蝦死亡后的質(zhì)量為W3，投餌總質(zhì)量為W4，試驗(yàn)開始時(shí)對(duì)蝦數(shù)量為n1，結(jié)束時(shí)對(duì)蝦數(shù)量為n2。通過公式(1)(2)(3)分別計(jì)算質(zhì)量增加率T、存活率RS，飼料系數(shù)RFC(feed conversion rate，F(xiàn)CR)。

T=(W2-W1)/W1×100%

(1)

RS=n2/n1×100%

(2)

RFC=W4/(W2+W3-W1)

(3)

1.4.2 常規(guī)成分測(cè)定

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，平行取對(duì)蝦肌肉樣品，進(jìn)行對(duì)蝦肌肉中的水分、粗蛋白、粗脂肪及粗灰分的常規(guī)成分測(cè)定。水分測(cè)定采用常壓恒溫干燥法[8]，粗蛋白測(cè)定采用凱氏定氮法[9]，粗脂肪測(cè)定采用索氏抽提法[10]，粗灰分測(cè)定采用550 ℃灼燒法[11]。

1.4.3 血清樣品的制備

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，在每個(gè)平行組中收集10～15尾蝦，用滅菌的1 mL注射器和5號(hào)針頭從蝦頭部的后緣插入心臟進(jìn)行采血。預(yù)先在注射器中加入已消毒的抗凝血?jiǎng)鼓獎(jiǎng)┡c對(duì)蝦血樣的體積比為1∶1。采集的血清樣品放置于離心管中,3 000 r/min，恒溫低速離心，取上清液放入4 ℃冰箱冷藏保存，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.4.4 非特異性免疫指標(biāo)

溶菌酶活力的測(cè)定采用王雷等[12]的方法。試管內(nèi)放入3 mL配置好的菌懸液并進(jìn)行冰浴，加入待測(cè)血清50 μL，混勻后，用分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)570 nm處的峰值(A1)；37 ℃水浴30 min，立即冰浴10 min后，同樣方法測(cè)定波長(zhǎng)570 nm處的峰值(A2)。用空白血清作為對(duì)照，消除血藍(lán)素的干擾。則溶菌酶活力UL為：

UL=(A1-A2)/A2

酚氧化酶活力的測(cè)定參考王雷等[12]的方法。

過氧化物酶PO活力的測(cè)定采用Ashida等[13]的方法。底物為左旋多巴(L-DOPA)，在96孔酶標(biāo)板小孔內(nèi)依次加入10 μL血清、0.1 mol/L磷酸鉀鹽緩沖液(pH=6.4)200 μL和0.01 mol/L L-DOPA 10 μL，在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處每隔2 min讀取一次吸光度。

超氧化物歧化酶SOD活力、堿性磷酸酶AKP活力、酸性磷酸酶ACP活力、過氧化氫酶CAT活力以及丙二醛MDA含量的測(cè)定，均采用酶測(cè)定專用試劑盒方法。專用試劑盒購買于南京建成生物工程研究所。

1.5 數(shù)據(jù)處理

測(cè)定結(jié)果以多次測(cè)量的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)形式表示，采用SPSS II軟件進(jìn)行組間差異顯著性比較，P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)生長(zhǎng)性能的影響

飼料中添加不同濃度靈芝多糖提取液對(duì)凡納濱對(duì)蝦的質(zhì)量增加率和特定生長(zhǎng)率的影響如表2所示。各組的存活率無顯著差異(P>0.05)；多糖Ⅰ組、多糖Ⅱ組和多糖Ⅲ組的末均質(zhì)量分別為15.93 g、15.28 g和15.72 g，均顯著高于對(duì)照組的14.38 g(P<0.05)；多糖Ⅱ組和多糖Ⅲ組的質(zhì)量增加率分別為244.60%和242.40%，比對(duì)照組的分別增加15.16%、14.12%，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，多糖Ⅰ組的質(zhì)量增加率為217.30%，與對(duì)照組的差異不顯著(P>0.05)；多糖Ⅱ組和多糖Ⅲ組的特定生長(zhǎng)率分別為4.62%和4.59%，顯著高于對(duì)照組的4.21%，差異顯著(P<0.05)，多糖Ⅰ組的特定生長(zhǎng)率與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)；在蛋白質(zhì)效率方面，多糖Ⅲ組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，多糖Ⅰ組和多糖Ⅱ組極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；多糖Ⅱ組的飼料系數(shù)最低，為1.12，顯著低于對(duì)照組、多糖Ⅰ組和多糖Ⅲ組(P<0.05)。

表2 靈芝多糖對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響

2.2 對(duì)常規(guī)成分的影響

飼料中添加不同濃度靈芝多糖提取液對(duì)養(yǎng)殖對(duì)蝦肌肉中的常規(guī)成分的影響見表3。與對(duì)照組相比，多糖Ⅰ組、多糖Ⅱ組和多糖Ⅲ組的對(duì)蝦肌肉中粗脂肪的含量顯著升高，差異顯著(P<0.05)，而水分、粗蛋白及粗灰分的含量差異不顯著(P>0.05)。

表3 靈芝多糖對(duì)凡納濱對(duì)蝦常規(guī)成分的影響

2.3 對(duì)非特異性免疫指標(biāo)的影響

表4是飼料中添加不同濃度靈芝多糖提取液對(duì)凡納濱對(duì)蝦溶菌酶活力的影響[14]。多糖Ⅰ組、多糖Ⅱ組和多糖Ⅲ組的溶菌酶活力與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，且多糖Ⅱ組和多糖Ⅲ組的溶菌酶活力與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，可見添加不同濃度靈芝多糖能夠提高對(duì)蝦的溶菌酶活力；多糖Ⅰ組、多糖Ⅱ組和多糖Ⅲ組的酚氧化酶活力與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，可見添加不同濃度靈芝多糖能夠提高對(duì)蝦的酚氧化酶活力；多糖Ⅰ組、多糖Ⅱ組和多糖Ⅲ組的堿性磷酸酶活力與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，且多糖Ⅱ組和多糖Ⅲ組的堿性磷酸酶活力與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，可見添加不同濃度靈芝多糖能夠提高對(duì)蝦的堿性磷酸酶活力；多糖Ⅰ組、多糖Ⅱ組和多糖Ⅲ組的酸性磷酸酶活力與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，可見添加不同濃度靈芝多糖能夠提高對(duì)蝦的酸性磷酸酶活力。

表4 靈芝多糖對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異免疫酶活力的影響

表5是飼料中添加不同濃度靈芝多糖提取液對(duì)凡納濱對(duì)蝦的抗氧化酶活力的影響。多糖Ⅰ組、多糖Ⅱ組和多糖Ⅲ組的超氧化物歧化酶活力與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，且多糖Ⅱ組的超氧化物歧化酶活力與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，可見添加不同濃度靈芝多糖能夠提高對(duì)蝦的超氧化物歧化酶活力；多糖Ⅰ組、多糖Ⅱ組和多糖Ⅲ組的過氧化氫酶活力與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，可見添加不同濃度靈芝多糖能夠提高對(duì)蝦的過氧化氫酶活力；多糖Ⅰ組、多糖Ⅱ組和多糖Ⅲ組的丙二醛含量與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，可見添加不同濃度靈芝多糖能夠提高對(duì)蝦的抗氧化酶活力。

表5 靈芝多糖對(duì)凡納濱對(duì)蝦抗氧化酶活力的影響

3 討論

3.1 靈芝多糖對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響

本試驗(yàn)將不同濃度的靈芝多糖提取液添加到基礎(chǔ)飼料中并投喂飼養(yǎng)凡納濱對(duì)蝦28 d，結(jié)果表明，靈芝多糖能夠不同程度的提高凡納濱對(duì)蝦質(zhì)量增加率、特定生長(zhǎng)率，降低飼料系數(shù)。這與Ai等[15]研究飼料中添加β-葡聚糖對(duì)大黃魚生長(zhǎng)的影響結(jié)果相似，與Misra等[16]研究飼料中添加β-葡聚糖對(duì)南亞鯪魚及紅鯛魚體免疫、生長(zhǎng)和存活的影響結(jié)果相似，與Cook[17]等發(fā)現(xiàn)將EcoActivaTM免疫刺激制劑作為飼料補(bǔ)充劑能夠增強(qiáng)嚙齒魚冬季的生長(zhǎng)速度結(jié)果相似，與楊福剛等[18]報(bào)道的飼料中添加β-葡聚糖能夠提高凡納濱對(duì)蝦稚蝦的質(zhì)量增加率、特定生長(zhǎng)率及飼料蛋白質(zhì)效率的結(jié)果也是相似的。

3.2 靈芝多糖對(duì)凡納濱對(duì)蝦常規(guī)成分的影響

楊福剛等[18]報(bào)道的飼料中添加β-葡聚糖還能夠提高凡納濱對(duì)蝦的粗脂肪含量，對(duì)粗蛋白、灰分和水分的含量影響并不顯著，本文結(jié)果與之相似，即添加靈芝多糖提取液能夠顯著提高粗脂肪的含量，但對(duì)對(duì)蝦的水分、粗蛋白及粗灰分含量無明顯影響。

3.3 靈芝多糖對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫指標(biāo)的影響

對(duì)蝦的免疫系統(tǒng)是非特異性的，其中溶菌酶在免疫防御中起著重要的作用[19]，溶菌酶活力是對(duì)蝦非特異性免疫功能的重要生理指標(biāo)之一。另外，在對(duì)蝦防御系統(tǒng)中，酚氧化酶起著異物識(shí)別和防御的功能，并且對(duì)維持對(duì)蝦防御系統(tǒng)中體液的無菌性有著至關(guān)重要的作用[20-21]。對(duì)蝦的肝胰腺負(fù)責(zé)解毒和代謝功能，由堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和超氧化物歧化酶等多種酶發(fā)揮作用，是對(duì)蝦的重要解毒器官。本研究發(fā)現(xiàn)，在凡納濱對(duì)蝦飼料中添加不同濃度的靈芝多糖提取液后，凡納濱對(duì)蝦的堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和超氧化物歧化酶均有不同程度的升高，血清中丙二醛的含量顯著降低，與王秀華等[22]研究肽聚糖制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫功能影響的結(jié)果一致。

免疫多糖具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能[23]，本研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖對(duì)增強(qiáng)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能和免疫力方面有一定的促進(jìn)作用，但作用機(jī)理尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。