宋明江，陳葉雨，吳曉雲(yún)，劉 亞，龔 全，賴見生

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，四川 成都 611731)

【研究意義】似鲇高原鰍(Triplophysasiluroides)屬鯉形目(Cypriniformes)，鰍科(Cobitidae)，條鰍亞科(Nemachilinae)，高原鰍屬，主要分布于青海、四川、甘肅的黃河上游[1]。似鲇高原鰍是中國特有的冷水性魚類，對高原環(huán)境有著極強(qiáng)的適應(yīng)性，是體型最大的一種鰍科魚類[2]。似鲇高原鰍是黃河流域的一種重要經(jīng)濟(jì)魚類，近年來，由于非法捕撈及生態(tài)環(huán)境的惡化，其野生資源量發(fā)生了嚴(yán)重的下降，已作為易危(vulnerable, VU)物種被列入《中國瀕危動物紅皮書》[3]。近年來, 似鲇高原鰍的人工繁育相繼取得了成功，在一定程度上彌補(bǔ)了種質(zhì)資源的不足。而在高密度人工繁育過程中，似鲇高原鰍出現(xiàn)疾病頻發(fā)、大面積死亡的現(xiàn)象，嚴(yán)重威脅其后續(xù)育種工作[4]?？咕膹V泛分布于上皮細(xì)胞表面，能抵御細(xì)菌、真菌、病毒及寄生蟲的入侵，同時(shí)還具有中和內(nèi)毒素、趨化免疫細(xì)胞、誘導(dǎo)血管生成、免疫調(diào)節(jié)及傷口修復(fù)等其他免疫活性[5]。與抗生素相比，抗菌肽作為一類小分子多肽，有著廣譜的殺菌功能，其直接作用于細(xì)菌細(xì)胞膜，不會使細(xì)菌對其產(chǎn)生抗性[6]。因此，對抗菌肽的研究將在水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病控制等領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】肝臟表達(dá)抗菌肽2 (Liver-Expressed Antimicrobial Peptide-2, LEAP-2)是2003年首次從人類血液中分離的一種新抗菌肽[7]，對革蘭氏陰性、陽性菌具有廣譜抗菌活性。目前，對達(dá)氏鱘(Acipenserdabryanus)[8]、金鯧(Trachinotusovatus)[9]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[10]，彈涂魚(Boleophthalmuspectinirostris)[11]、鮸(Miichthysmiiuy)[12]、鯉魚(CyprinuscarpioL.)[13]、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[14]和香魚(Plecoglossusaltivelis)[15]等多種魚類的LEAP-2基因均有相關(guān)研究。【本研究切入點(diǎn)】目前，對似鲇高原鰍的研究主要集中于人工養(yǎng)殖技術(shù)、地理種群遺傳多樣性分析及分子標(biāo)記的開發(fā)等，對似鲇高原鰍疾病方面的研究僅限于病原微生物的分離，有關(guān)抗菌肽及其免疫調(diào)控等的研究還處于空白階段?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究首次從似鲇高原鰍中分離出LEAP-2基因，分析其序列特征和系統(tǒng)進(jìn)化的關(guān)系，并研究其在健康組織和細(xì)菌侵染下的組織表達(dá)特征，為似鲇高原鰍抗菌肽的應(yīng)用和疾病防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用似鲇高原鰍采集于四川巨海漁業(yè)科技有限公司養(yǎng)殖基地，所有實(shí)驗(yàn)用魚在處理前均用循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)暫養(yǎng)2周。用于組織分布和細(xì)菌侵染實(shí)驗(yàn)的魚為人工繁殖的子一代，平均體重24.6 g。攻毒實(shí)驗(yàn)選取的遲緩愛德華氏菌菌株取自四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所分子實(shí)驗(yàn)室。

1.2 基因序列分析

似鲇高原鰍LEAP-2基因cDNA序列從前期對似鲇高原鰍進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫中獲得[16]?；蜷_放閱讀框ORF使用軟件Vector NTI 10.3.0分析。信號肽預(yù)測使用SignalP 5.0在線網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)?；蛲葱圆檎壹巴椿蚴褂肗CBI在線網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行下載。似鲇高原鰍與其余物種LEAP-2相應(yīng)氨基酸序列的多重比對利用軟件ClustalX進(jìn)行，序列多重比對圖使用DNAMAN繪制。使用Mega 6軟件中的Neighbor-joining法構(gòu)建不同物種LEAP-2的進(jìn)化樹。

1.3 組織表達(dá)分析

選取3尾健康的似鲇高原鰍，用于檢測LEAP-2基因的組織分布情況。似鲇高原鰍用MS-222麻醉后，分別分離鰓、腎臟、肝臟、肌肉、胃、腦、腸道、脾臟、皮膚、眼睛和心臟共11個(gè)組織，速凍于液氮，隨后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，用于提取RNA。總RNA使用TRIzol試劑進(jìn)行提取，RNA質(zhì)量通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行初檢，其純度和完整度通過超微量分光光度計(jì)進(jìn)行檢測分析。質(zhì)量合格的RNA使用Prime Script RT reagent Kit With gDNA Eraser (Takara, 日本)。

1.4 細(xì)菌侵染下LEAP-2基因的表達(dá)量檢測

將保存的遲緩愛德華氏菌進(jìn)行復(fù)蘇并培養(yǎng)至生長對數(shù)期，調(diào)至終濃度為1.6×106CFU/mL，每尾魚注射200 μL的菌液。分別于細(xì)菌注射后0，12，24，48，72和96 h共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集似鲇高原鰍皮膚、鰓、腸道、腎臟、肝臟和脾臟6個(gè)組織進(jìn)行液氮速凍并保存，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選取3條魚作為重復(fù)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

LEAP-2基因的時(shí)空表達(dá)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行。PCR擴(kuò)增體系為20 μL，包括10 μL TB Green Premix ExTaqTMII (Takara, 日本)，4 μL 20倍稀釋后的cDNA模板，上下游特異性引物各1 μL(表1)和4 μL PCR級滅菌水。PCR擴(kuò)增體系如下：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性5 s，59 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)；最終70～95 ℃獲取熔解曲線。內(nèi)參基因選取β-Actin，采用2-ΔΔCt法計(jì)算樣品中LEAP-2基因mRNA的相對表達(dá)量，每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

在遲緩愛德華氏菌攻毒實(shí)驗(yàn)中，以未注射細(xì)菌的個(gè)體為對照(0 h)，使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行顯著性分析。基于單因素方差分析基礎(chǔ)上，采用Turkey多重比較法對攻毒組和未攻毒組之間的差異進(jìn)行檢驗(yàn)，P< 0.05時(shí)為顯著差異。

表1 LEAP-2基因熒光定量PCR檢測所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 似鲇高原鰍LEAP-2序列及系統(tǒng)進(jìn)化分析

似鲇高原鰍LEAP-2cDNA序列為2253 bp，其中5’非編譯區(qū)(UTR)為270 bp，3’非編譯區(qū)為1698 bp，3’UTR區(qū)域有明顯的多聚腺苷酸化信號AATAAA序列(圖1)。開放閱讀框?yàn)?85 bp，編碼94個(gè)氨基酸。信號肽預(yù)測結(jié)果顯示LEAP-2信號肽包含28個(gè)氨基酸殘基。將似鲇高原鰍和其他魚類的LEAP-2氨基酸序列進(jìn)行比對(圖2)，序列相似性依次如下：西藏高原鰍(Triplophysatibetana, 95.74%)，大鱗泥鰍(Misgurnusmizolepis, 80.85%)，團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala, 77.66%)，白甲(Onychostomamacrolepis, 77.66%)，撫仙金線鲃 (Sinocyclocheilusgrahami, 77.66%)，草魚(Ctenopharyngodonidella, 76.60%)，安水金線鲃(S.anshuiensis, 75.53%)，唇(魚骨)(Hemibarbuslabeo, 72.34%)和鯉魚(Cyprinuscarpio, 72.34%)。

采用Mega 6繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，似鲇高原鰍的LEAP-2與西藏高原鰍LEAP-2聚在一支，置信度為99%。似鲇高原鰍與西藏高原鰍LEAP-2與其余魚類LEAP-2基因聚為一個(gè)大的分支，而哺乳動物人和小鼠LEAP-2聚在另一分支。

2.2 LEAP-2在不同組織的表達(dá)水平

LEAP-2在健康似鲇高原鰍的鰓、腎臟、肝臟、肌肉、胃、腦、腸道、脾臟、皮膚、眼睛和心臟共11個(gè)組織中均有表達(dá)(圖4)，但表達(dá)水平不一。其中，LEAP-2在似鲇高原鰍肝臟中的表達(dá)量最高，是在鰓中表達(dá)量的2000多倍。其次為心臟和皮膚，在腦和鰓中表達(dá)量最低。

2.3 遲緩愛德華氏菌侵染作用下似鲇高原鰍LEAP-2表達(dá)量的變化

在遲緩愛德華氏菌作用下，似鲇高原鰍LEAP-2mRNA表達(dá)量在各免疫組織中呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(圖5)。在粘膜相關(guān)組織皮膚、鰓和腸道中，細(xì)菌侵染后48 h，皮膚中的LEAP-2出現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05)。侵染72 h后，皮膚、鰓和腸道中的LEAP-2均出現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05)。細(xì)菌侵染96 h后，鰓組織中的LEAP-2恢復(fù)到原始表達(dá)水平，而皮膚和腸道中的LEAP-2仍顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05)。在系統(tǒng)性免疫組織脾臟、肝臟和腎臟中，肝臟中的LEAP-2在細(xì)菌侵染24 h時(shí)顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05)，隨后下降。脾臟中LEAP-2先下降表達(dá)，隨后在侵染48 h和72 h時(shí)顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05)，在96 h時(shí)恢復(fù)到正常表達(dá)水平。腎臟中的LEAP-2在攻毒96 h上調(diào)表達(dá)(P<0.05)。

3 討 論

本研究中，在似鲇高原鰍中鑒定出了LEAP-2序列，序列比對表明，該基因與其他魚類的LEAP-2基因序列高度一致。本研究將似鲇高原鰍LEAP-2氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行BLAST檢索分析，發(fā)現(xiàn)與其他魚類的LEAP-2同源性在70%以上，說明硬骨魚中LEAP-2序列保守度較高。似鲇高原鰍LEAP-2基因在N端有一個(gè)信號肽序列，與其他物種的LEAP-2相同[8, 12-13, 17-19]。成熟肽C末端含有4種保守的半胱氨酸，可以形成2個(gè)二硫鍵，這是抗菌肽基因具有抗菌活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。似鲇高原鰍LEAP-2成熟肽上富含帶正電荷的氨基酸殘基，可與微生物外膜上帶負(fù)電荷的基團(tuán)相互作用[20]。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示似鲇高原鰍LEAP-2與其余魚類LEAP-2基因聚為一個(gè)大的分支，與西藏高原鰍同源性最高，聚為一小支，進(jìn)一步證實(shí)似鲇高原鰍LEAP-2是其他魚類LEAP-2的同源物。

肝臟幾乎是所有脊椎動物L(fēng)EAP-2的主要表達(dá)組織。在不同水生動物中，LEAP-2的組織表達(dá)模式有所不同。例如，虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[21]和中華鱉(Pelodiscussinensis)[22]中的LEAP-2只在肝臟中表達(dá)，在其余組織中檢測不到。而虹鱒LEAP-2也在其他組織中誘導(dǎo)表達(dá)，如腸組織和皮膚等。在其他物種例如草魚[10]，鮸[12]，團(tuán)頭魴[14]，香魚[15]，條石鯛(Oplegnathusfasciatus)[23]和日本鰻鱺(Anguillajaponica)[24]中，LEAP-2轉(zhuǎn)錄本則存在于多種組織中，包括肝臟、脾臟、頭腎和皮膚，肝臟為表達(dá)量最高的組織。在本研究中，LEAP-2轉(zhuǎn)錄本也普遍表達(dá)于似鲇高原鰍各檢測組織，且在肝臟中高表達(dá)，高于表達(dá)量最低組織2000多倍，與達(dá)氏鱘LEAP-2的表達(dá)模式相似。研究結(jié)果表明，在正常情況下，似鲇高原鰍LEAP-2發(fā)揮生物學(xué)功能的場所主要集中在肝臟，而不是其他系統(tǒng)性免疫或粘膜免疫組織。

為進(jìn)一步探索似鲇高原鰍LEAP-2在免疫應(yīng)答反應(yīng)中的功能，本研究用遲緩愛德華氏菌對似鲇高原鰍進(jìn)行侵染，并研究LEAP-2在細(xì)菌侵染后的表達(dá)模式。研究結(jié)果表明，在遲緩愛德華氏菌作用下，各免疫組織中LEAP-2的表達(dá)量出現(xiàn)了顯著性變化，且在不同免疫組織中呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。首先，非常值得關(guān)注的是，除肝臟LEAP-2在侵染24 h后有小幅度上調(diào)表達(dá)外，其余時(shí)間段肝臟中的LEAP-2表達(dá)量與對照組相比都成下降趨勢。肝臟為LEAP-2的主要表達(dá)組織，細(xì)菌侵染后出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)推測肝臟里的LEAP-2可能轉(zhuǎn)移至其他免疫組織，用于對抗細(xì)菌的侵染。肝臟中LEAP-2受到侵染后的表達(dá)模式變化同大鱗泥鰍(Misgurnusmizolepis)類似，其LEAP-2在遲緩愛德華氏菌作用后，也表現(xiàn)出先上升后下降的模式[25]。在粘膜免疫相關(guān)組織皮膚、鰓和腸道中，LEAP-2的表達(dá)量均出現(xiàn)顯著上升，尤其是腸道組織的變化最為顯著，與對照組相比在侵染后72和96 h后上升了幾十倍，說明腸道在似鲇高原鰍對抗細(xì)菌侵染過程中發(fā)揮了重要作用。虹鱒LEAP-2在殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida) 作用后，皮膚和腸道中的LEAP-2被誘導(dǎo)表達(dá)[21]。在草魚和團(tuán)頭魴中，細(xì)菌誘導(dǎo)后大部分組織中均檢測到LEAP-2表達(dá)上調(diào)。在其他硬骨魚的不同組織中，在細(xì)菌攻毒后也觀察到類似的LEAP-2mRNA水平的上調(diào)，因此，LEAP-2被認(rèn)為有助于防御病原菌的入侵。皮膚、鰓和腸道為魚類主要的粘膜免疫相關(guān)組織，細(xì)菌侵染后，LEAP-2在該類組織中的顯著性上調(diào)表達(dá)，提示著似鲇高原鰍LEAP-2在機(jī)體粘膜免疫過程中的重要作用。為了充分了解LEAP-2在抵抗病原菌方面的作用，需要進(jìn)一步通過外源表達(dá)獲得重組蛋白，或通過化學(xué)合成，研究重組或合成的似鲇高原鰍LEAP-2的體外抗菌活性。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)首次從似鲇高原鰍中分離得到LEAP-2的cDNA序列，得到了其在鰓、腎臟、肝臟、肌肉、胃、腦、腸道、脾臟、皮膚、眼睛和心臟共11個(gè)組織的表達(dá)情況，并研究了細(xì)菌感染下，LEAP-2mRNA在不同組織中的表達(dá)狀況，結(jié)果顯示似鲇高原鰍LEAP-2參與到了機(jī)體對抗細(xì)菌侵染的免疫應(yīng)答反應(yīng)過程中，為以后似鲇高原鰍LEAP-2的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。