王 娜，徐嘉翼，葉 鑫，隋世江，張 鑫，牛世偉

(遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物營養(yǎng)與環(huán)境資源研究所，遼寧 沈陽 110161)

【研究意義】土壤微生物是物質(zhì)循環(huán)的調(diào)節(jié)者，對土壤有機物的分解和養(yǎng)分循環(huán)起關(guān)鍵作用，對維持生態(tài)平衡穩(wěn)定具有重要意義[1-3]。微生物作為土壤養(yǎng)分的源和庫[4]，可以固定礦質(zhì)養(yǎng)分，降低養(yǎng)分的損失；另外也參與有機質(zhì)礦化，釋放礦質(zhì)養(yǎng)分，滿足作物的需要。土壤微生物對環(huán)境變化較為敏感，除了氣候、土壤等自然因素，人為活動也會對微生物產(chǎn)生諸多影響。在農(nóng)田種植生產(chǎn)中，施肥是必要且常見的人為生產(chǎn)活動，其對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響已被廣泛報道[5-7]。合理施有機肥或無機肥均能提高稻田土壤微生物的數(shù)量和活性，進而調(diào)控土壤氮素的循環(huán)轉(zhuǎn)化過程，提高土壤有效氮的濃度，促進水稻根系對氮素吸收，因此研究肥料與土壤微生物之間的響應(yīng)關(guān)系對于理解土壤養(yǎng)分調(diào)控機制具有指導(dǎo)意義。目前稻田施用的氮肥大多數(shù)是常規(guī)尿素，其成本低、養(yǎng)分供應(yīng)快，但長期過量施用易引起養(yǎng)分流失、土壤酸化等問題[8]，導(dǎo)致周圍水體富營養(yǎng)化，同時造成土壤質(zhì)量降低，嚴重影響了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與功能。常規(guī)尿素利用率低，由此帶來的環(huán)境污染，一直是困擾農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的問題[9]。為此，具有肥效長且穩(wěn)定、利用率高等特點的控釋肥料受到越來越多的關(guān)注，其對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響也成為研究熱點[10]。李新悅等[11]研究控釋摻混氮肥對稻麥土壤微生物的影響，結(jié)果表明在水稻拔節(jié)至成熟期，施用控釋摻混氮肥的土壤細菌數(shù)量較單施尿素提高了54.36%～66.96%，較單施控釋氮肥提高19.47%～69.92%。李杰等[12]研究新型聚氨酸增效肥料對土壤微生物量和活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新型聚氨酸增效肥料顯著增加了小白菜土壤微生物量，提高了土壤微生物活性，能夠有效延緩肥料氮素的釋放。聚天門冬氨酸/鹽(PASP)，是一種環(huán)境友好型綠色聚合物，具有生物降解特性及富集離子作用，既能提高肥料利用率，又能減少肥料流失給環(huán)境帶來的污染，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到大量應(yīng)用[13-14]?！厩叭搜芯窟M展】杜中軍等[15]研究表明聚天門冬氨酸同源多肽分子與養(yǎng)分離子形成易于水稻吸收的螯合態(tài)，促進水稻對養(yǎng)分的吸收。楊勇等[16]研究表明PASP能夠有效延長肥效，減少化肥流失，活化養(yǎng)分元素，提高化肥利用率，促進水稻增產(chǎn)?！颈狙芯壳腥朦c】目前關(guān)于PASP研究主要集中在對水稻養(yǎng)分吸收及增產(chǎn)作用等方面，而對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)等方面少有報道，尤其能否調(diào)控土壤微生物群落結(jié)構(gòu)并影響氮素釋放與轉(zhuǎn)化尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究選用0.3%聚天門冬氨酸鈣鹽(PASP-Ca)與尿素復(fù)配，利用Illumina高通量測序技術(shù)分析稻田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征，探討PASP-Ca尿素對土壤微生物多樣性和氮素形態(tài)的影響。本研究以期掲示PASP與氮素-土壤-微生物間互作的生態(tài)學(xué)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗地位于盤錦市盤山縣壩墻子鎮(zhèn)煙李村，地處遼河三角洲，屬溫帶半濕潤大陸性季風(fēng)氣候類型，年均降雨量612 mm，年均氣溫8.4 ℃，無霜期165～170 d。供試土壤為水稻土，耕層土壤理化性質(zhì)為有機質(zhì)17.7 g/kg、全氮1.58 g/kg、水解性氮71 mg/kg、有效磷43.28 mg/kg、有效鉀185.5 mg/kg、pH 7.8。

1.2 供驗材料

供試水稻品種為鹽豐47號。5月12日施基肥，5月22日插秧，插秧密度為30 cm×16.5 cm，6月24日追蘗肥，10月8日收獲水稻。氮肥為大顆粒尿素(N 46%)、磷肥為磷酸二銨(P2O546%、N 18%)、鉀肥為氯化鉀(K2O 60%)、聚天門冬氨酸鈣鹽(PASP-Ca，用量為尿素重量0.3%)。

1.3 試驗設(shè)計

試驗共設(shè)置2個處理，T1處理氮肥用常規(guī)尿素，T2處理氮肥用0.3% PASP-Ca復(fù)配常規(guī)尿素。各處理氮肥、磷肥和鉀肥用量均分別為N 210 kg/hm2、P2O590 kg/hm2和K2O 90 kg/hm2。氮肥施用比例為基肥占80%、蘗肥占20%，磷鉀肥全部基施。試驗面積為400 m2，每個處理3次重復(fù)，隨機區(qū)組排列。田間管理與當?shù)叵嗤?/p>

1.4 樣品采集與測定

在施入基肥后第3、5、10 天，采用5點法取0～20 cm土壤樣品。一部分土壤樣品迅速裝入無菌聚氯乙烯(PVC)盒，置于冰上盡快運至實驗室于-80 ℃保存，用于微生物檢測。另一部分土壤樣品于-20 ℃保存，采用紫外分光光度計法測定土壤硝態(tài)氮濃度，靛酚藍比色法測定土壤銨態(tài)氮濃度[17]。

1.5 細菌測序

提取土壤總DNA，然后擴增獲得的片段，通過1%的瓊脂糖凝膠電泳進行純化和回收后，由北京百邁客生物科技有限公司進行文庫構(gòu)建，Illumina MiSeq測序。

1.6 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析

1.6.1 原始數(shù)據(jù)序列分析 使用FLASH v 1.2.7軟件[18]，通過overlap對每個樣品的測序序列(reads)進行拼接，得到的拼接序列即原始Tags數(shù)據(jù)(Raw Tags)；使用Trimmomatic v 0.33軟件[19]，對拼接得到的Raw Tags進行過濾，片段大小得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)(Clean Tags)；使用UCHIME v4.2軟件[20]，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)。

1.6.2 操作分類單元分析 使用QIIME(version 1.8.0)軟件[21-22]中的UCLUST對Tags在97%相似度水平下進行聚類，獲得操作分類單元(OTU)，并基于Silva(細菌)分類學(xué)數(shù)據(jù)庫[23]對OTU進行分類學(xué)注釋和生物信息學(xué)統(tǒng)計分析。用R語言軟件繪制群落組成Venn圖，展示各處理樣品之間共有、特有OTUs數(shù)目。

1.6.3 細菌多樣性分析 利用Mothur軟件[24]計算Alpha多樣性指數(shù)(Ace、Chao、Shannon、Simpson)。Ace和Chao指數(shù)表示物種的數(shù)量，Shannon和Simpson指數(shù)表示物種的多樣性，相同物種豐富度的情況下，Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，說明樣品的物種多樣性越高[25]。

1.6.4 細菌顯著差異分析 利用LEfSet[26][Line Discriminant Analysis (LDA) Effect Size]分析首先使用kruskal-Wallis秩和檢驗方法尋找多組間顯著差異的物種(P< 0.05)，然后根據(jù)第一步得到的差異物種使用線性判別分析計算每個物種的LDA值，最后根據(jù)LDA值篩選組間具有統(tǒng)計學(xué)差異的biomarker，進行處理間物種差異顯著性分析。LEfSe分析進化分枝圖由內(nèi)至外輻射的圓圈代表了由門至種的分類級別；在不同分類級別上的每一個小圓圈代表該水平下的一個分類，小圓圈直徑大小與相對豐度大小呈正比；著色原則為將無顯著差異的物種統(tǒng)一著色為黃色，其他差異物種按該物種所在豐度最高的分組進行著色。

1.6.5 物種與環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析 冗余分析法(Redundancy Analysis，RDA)是同時使用環(huán)境因子和物種組成數(shù)據(jù)進行限制性排序的生態(tài)學(xué)多元數(shù)據(jù)分析方法，可以綜合分析多個環(huán)境因子，得出環(huán)境因子與物種之間的排序圖，圖中可直觀的顯示出物種分布和環(huán)境因子間的關(guān)聯(lián)，是分析生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子之間相關(guān)性的有效途徑[27]。

1.7 其它相關(guān)數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件中獨立樣本T檢驗對同采樣天數(shù)不同施肥處理間Alpha多樣性指數(shù)和土壤養(yǎng)分進行差異性顯著分析；采用SPSS 19.0軟件中單因素分析方法(One-Way ANOVA)對同施肥處理不同采樣天數(shù)間Alpha多樣性指數(shù)進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤細菌群落總體變化分析

2.1.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估 18個土壤樣品共得到1030 357條序列，其中921 829條為優(yōu)質(zhì)序列，占所有序列的89.5%。平均每個樣品的序列條數(shù)為16 813，平均序列長度為421 bp。在相似度為97%水平上，18個土壤樣品中OTUs數(shù)為1188到1791，覆蓋了土壤中約為99.45%～99.84%的細菌，說明測序數(shù)據(jù)量合理，能真實反應(yīng)土壤細菌的群落組成。

2.1.2 土壤細菌OTUs Venn圖分析 從圖1可以看出，從施肥后第3天至第10天，常規(guī)尿素T1處理與PASP-CA尿素T2處理共有OTUs數(shù)呈先增加后降低趨勢，且顯著高于特有細菌，這表明兩個處理的OTUs數(shù)可能受尿素降解與轉(zhuǎn)化過程影響，且大部分細菌群落結(jié)構(gòu)相似。在施肥后第5天，T1處理與T2處理OTUs總數(shù)最多，分別為1947 和1935種，兩處理共有OTUs數(shù)也最多，為1910種，這說明PASP-Ca尿素對施肥后第5天土壤細菌OTUs影響較小。而在施肥后第3、10天，T1處理和T2處理特有OTUs分別為18 和49種、24 和87種，且T2處理特有OTUs數(shù)均高于T1處理，而在第5天T2處理特有OTUs數(shù)低于T1處理，這表明PASP-Ca尿素增加了第3、10天土壤樣品中特有OTUs的數(shù)量。

2.1.3 土壤細菌Alpha多樣性指數(shù) 如表1所示，對各處理的OTUs進行Alpha多樣性指數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)施肥后第3天至第10天，T1、T2處理ACE指數(shù)均呈現(xiàn)先增加后降低趨勢，這表明隨著尿素的釋放與轉(zhuǎn)化，土壤細菌豐富度逐漸增加，在施肥后第5天達到峰值后呈不同趨勢下降。其中T1處理第5天ACE指數(shù)顯著高于第3、10天，T2處理第5、10天ACE指數(shù)顯著高于第3，5與10天差異不顯著，而T2處理第3天ACE指數(shù)高于T1處理，第5、10天ACE指數(shù)低于T1處理，無顯著差異，這說明PASP-Ca尿素可增加施肥初期細菌豐富度且保持施肥后期細菌豐富度相對穩(wěn)定。兩個處理Chao指數(shù)也呈現(xiàn)先增加后降低趨勢，其中T1處理第5天Chao指數(shù)顯著高于第3、10天，而T2處理第3、5、10天Chao指數(shù)差異不顯著，且在第10天T2處理Chao指數(shù)顯著高于T1處理，這也表明隨著尿素的釋放與轉(zhuǎn)化，常規(guī)尿素處理細菌豐富度變化較大而PASP-Ca尿素能夠保持細菌豐富度相對穩(wěn)定。施肥后第3天，T2處理Shannon指數(shù)高于T1處理，且T2處理Simpson指數(shù)低于T1處理，無顯著差異，這表明在施肥初期，PASP-Ca尿素具有增加土壤細菌多樣性的潛力。

表1 各個處理Alpha多樣性指數(shù)值

2.2 土壤N素硝化相關(guān)細菌變化

2.2.1 土壤細菌群落組成 選擇物種豐度比例大于1%的前10個優(yōu)勢物種繪制目水平分布柱狀圖(圖2)，并對與氮素循環(huán)相關(guān)的細菌進行差異顯著性分析(表2)。從圖2中可以看出，T1、T2處理土壤樣品中50%左右為其他物種，10%～20%未能進行分類鑒定。除此之外，Nitrosomonadales(亞硝化單胞菌目)相對豐度最高，其可能是參與氮素循環(huán)的主要貢獻者，其次為Xanthomonadales(黃單胞桿菌目)、Nitrospirales(硝化螺旋菌目)和Sphingobacteriales(鞘脂桿菌目)。在施肥后第3天，T1處理細菌相對豐度高于T2處理的優(yōu)勢目有：Xanthomonadales，T1處理為9.16%、T2處理為7.32%；其次是Sphingobacteriales，T1處理為4.74%、T2處理為4.47%；而T2處理物種相對豐度高于T1處理的優(yōu)勢目有：主要以未分類細菌為主，占比為11.34%；其次是Nitrosomonadales，T1處理為4.90%、T2處理為5.64%。在施肥后第5天，T1處理細菌相對豐度高于T2處理的優(yōu)勢目有：Nitrosomonadales，T1處理為8.47%、T2處理為5.69%；其次是Nitrospirales，T1處理為4.39%、T2處理為3.29%；而T2處理物種相對豐度高于T1處理的優(yōu)勢目有：主要以未分類細菌為主，占比為18.76%；其次是Sphingobacteriales，T1處理為2.33%、T2處理為2.53%。在施肥后第10天，T1處理物種相對豐度高于T2處理的優(yōu)勢目有：Nitrosomonadales，T1處理為9.73%、T2處理為7.76%；其次是Nitrospirales，T1處理為3.64%、T2處理為2.93%；而T2處理物種相對豐度高于T1處理的優(yōu)勢目有：主要以未分類細菌為主，占比為15.28%；Xanthomonadales，T1處理為3.60%、T2處理為4.01%?？梢姡Ｒ?guī)尿素T1處理和PASP-Ca尿素T2處理的優(yōu)勢物種細菌群落組成基本一樣，但優(yōu)勢物種細菌相對豐度存在一定差異。

表2 施肥后第3、5、10天與氮素循環(huán)相關(guān)細菌目水平的相對豐度

表3 施肥后第3、5、10天土壤細菌屬水平LDA打分

如表2所示，在施肥后第3、5和10天，Nitrosomonadales相對豐度呈逐漸增加趨勢，其中T1處理第5、10天相對豐度顯著高于第3天，而T2處理各時期差異不顯著；Nitrospirales相對豐度呈先增加后減少趨勢，T1處理第5天其相對豐度顯著高于第3天，而T2處理各時期差異不顯著；Xanthomonadales、Sphingobacteriales相對豐度呈逐漸減少趨勢，T1、T2處理第3天其相對豐度顯著高于第5、10天。由此可見，在施肥后第3、5和10天，T2處理中與N素硝化相關(guān)的Nitrosomonadales、Nitrospirales相對豐度穩(wěn)定，這可能與添加PASP-Ca有關(guān)。

2.2.2 土壤細菌屬水平差異分析 根據(jù)LEfSe分析兩組間豐度差異顯著的物種，紅色節(jié)點表示在常規(guī)尿素T1處理的土壤中起重要作用的細菌類群，綠色節(jié)點表示在PASP-CA尿素T2處理的土壤中起重要作用的細菌類群(圖3)。如圖3所示，在施肥后第3、10天，T1和T2處理均有差異顯著的物種，而在第5天，T1處理有3種差異顯著的物種，T2處理無差異顯著的物種。由于土壤細菌測序獲得的數(shù)據(jù)量較大，將LEfSe分析結(jié)果結(jié)合LDA打分篩選出LDAScore>3差異顯著的菌屬(表3)。如表3所示，在施肥后第3天，以Gillisia(泥灘微菌屬)、Lysobacter(溶桿菌屬)、Pontibacter(海洋桿菌屬)等為主的細菌在T1處理的土壤菌群結(jié)構(gòu)組成起到重要作用。Subgroup 7、Nitrospiraceae(硝化螺旋菌科)在T2處理的土壤菌群結(jié)構(gòu)組成起到重要作用。在施肥后第5天，Gillisia、Pontibacter、Geobacter(地桿菌屬)在T1處理的土壤菌群結(jié)構(gòu)組成起到重要作用。在施肥后第10天，以Gemmatimonadaceae(芽單胞菌科)、Nitrosomonadaceae(亞硝化單胞科)、Latescibacteria(匿桿菌門)等為主的細菌在T1處理的土壤菌群結(jié)構(gòu)組成起到重要作用。Bacillus(芽孢桿菌屬)、Psenudomonas(熒光假單胞菌屬)、Streptomyces(鏈霉菌屬)在T2處理的土壤菌群結(jié)構(gòu)組成起到重要作用。上述細菌主要功能與生物防治、生物修復(fù)、有機肥降解以及氮循環(huán)等相關(guān)，其中與N素硝化相關(guān)的細菌主要有Nitrospiraceae和Nitrosomonadaceae。在施肥第3天，Nitrospiraceae是T2處理土壤菌群重要組成部分，而在施肥后第10天，Nitrosomonadaceae是T1處理土壤菌群重要組成部分。

表4 不同處理土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量

2.3 土壤氮素含量變化分析

2.4 細菌群落與土壤氮素的關(guān)聯(lián)分析

3 討 論

聚天門冬氨酸/鹽(PASP)是一種氨基酸類聚合物，天然的聚天門冬氨酸主要存在于軟體動物和蝸牛類的殼中[28]。聚天門冬氨酸分子具有類似于蛋白質(zhì)的酰胺鍵結(jié)構(gòu)，微生物中相應(yīng)的酶能夠進入PASP的活性位點，使結(jié)構(gòu)主鏈發(fā)生分解并斷裂成片段，最終分解為小分子物質(zhì)(CO2、H2O)，實現(xiàn)完全生物降解[29]。PASP-Ca與尿素復(fù)配后可包裹在尿素的外層，通過自身緩慢的生物降解逐漸釋放尿素，使氮肥在水稻生育期內(nèi)持續(xù)發(fā)揮作用，同時PASP-Ca還能夠鰲合、吸附田面水和土壤中的養(yǎng)分輸送并富集到水稻根系周圍，供水稻吸收利用，這將大大地減少氮素流失與揮發(fā)[30-31]。本試驗中，通過對各處理的OTUs Venn分析，結(jié)果顯示：從施肥后第3～10天，兩個處理的OTUs數(shù)呈先增加后降低趨勢，且兩個處理的大部分細菌群落結(jié)構(gòu)相似，而PASP-Ca尿素能夠增加第3、10天土壤樣品中特有OTUs的數(shù)量。通過對各處理的OTUs進行Alpha多樣性指數(shù)分析，結(jié)果顯示：施肥后第3天至第10天，兩個處理的ACE指數(shù)和Chao指數(shù)呈現(xiàn)增加后降低趨勢，其中T1處理第5天ACE指數(shù)顯著高于第3、10天，T2處理第5、10天的ACE指數(shù)顯著高于第3天，第5天與第10天差異不顯著，且T2處理第3天ACE指數(shù)高于T1處理。這表明隨著尿素的釋放與轉(zhuǎn)化，土壤細菌豐富度逐漸增加，常規(guī)尿素處理細菌豐富度變化較大而PASP-Ca尿素處理可增加施肥初期細菌豐富度且保持施肥后期細菌豐富度相對穩(wěn)定。

4 結(jié) 論

本文通過Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)分析表明，PASP-Ca尿素通過調(diào)控參與N素硝化的土壤細菌豐度，改變了土壤細菌群落多樣性，影響N素的硝化過程，對降低氮素流失風(fēng)險和提高氮肥利用率具有潛在作用。本試驗僅開展1年，因此有必要通過室內(nèi)培養(yǎng)試驗和大田多年定點試驗深入研究PASP與土壤微生物和土壤養(yǎng)分之間的互作關(guān)系。