王國(guó)強(qiáng)，張怡青，李 果，蘇運(yùn)芳，李玉林，尚立芝， 畢勝利，樊志浩，李生濤，張振強(qiáng)*，王云龍*

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2.河南省生物工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450002；3.鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450000；4.南陽(yáng)農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 南陽(yáng) 473000)

【研究意義】非洲豬瘟(African Swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African Swine fever virus，ASFV)引起的家豬、野豬的一種急性、熱性、高度接觸性動(dòng)物傳染病，所有品種和年齡的豬均可感染，發(fā)病率和死亡率高可達(dá)100%[1-3]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health，OIE)將其列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病，中國(guó)也將其列為一類動(dòng)物疫病[4]。1921年ASFV首先在肯尼亞被發(fā)現(xiàn)，1957年傳入歐洲，1971年傳入南美，2017年傳至俄羅斯并向東擴(kuò)算至遠(yuǎn)東地區(qū)距離我國(guó)僅約1000 km的伊爾庫(kù)茨克州，2018年傳入我國(guó)[5-7]。2018年8月，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部通報(bào)中國(guó)首例非洲豬瘟疫情，隨后病毒很快傳播到全國(guó)大部分地區(qū)。至今疫情已擴(kuò)散至33個(gè)省份，超過(guò)130萬(wàn)頭家豬被撲殺，全國(guó)能繁母豬存欄數(shù)量從2018年1月的4000萬(wàn)頭降至了2019年7月的不足500萬(wàn)頭，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[8-9]。中國(guó)是全世界最大的豬肉生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)，面對(duì)近百年來(lái)ASFV首次進(jìn)入及蔓延，我們對(duì)其入侵、組裝、逃逸機(jī)制及相關(guān)蛋白相關(guān)研究還很不完善，迫切需要研究清楚ASFV功能蛋白作用，尤其是結(jié)構(gòu)蛋白功能，為后期有效疫苗研發(fā)和ASFV防控提供支持?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】ASFV是一種獨(dú)特的雙鏈DNA病毒，直徑長(zhǎng)約250～260 nm，其基因組十分龐大而復(fù)雜，含有 150～167 個(gè)開(kāi)放閱讀框(Open reading frames，ORFs)，可編碼68種結(jié)構(gòu)蛋白及100多種非結(jié)構(gòu)蛋白，其中一半蛋白功能未知[10-12]，對(duì)其病毒入侵、宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、復(fù)制傳播、保護(hù)性免疫以及逃逸機(jī)制仍然知之甚少[13]。這限制了ASFV復(fù)制、毒力相關(guān)基因的鑒定，以及基因工程疫苗的研制。但是隨著冷凍電鏡、病毒培養(yǎng)、晶體結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析等技術(shù)的成熟，ASFV主要結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)象、功能、病毒入侵和逃逸機(jī)制及相關(guān)蛋白逐漸清晰。冷凍電鏡結(jié)構(gòu)表明：ASFV具有獨(dú)特、精巧而復(fù)雜的五層結(jié)構(gòu)，從外到內(nèi)分別是外(囊)膜(Outer membrane)、衣殼(Capsid)、內(nèi)膜(Inner membrane)、內(nèi)核心殼(Core shell)以及核心基因組(Nucleoid)，像是一個(gè)“俄羅斯套娃”，一層層嵌套，外層衣殼保護(hù)著內(nèi)層蛋白和核酸結(jié)構(gòu)[14-16]。2019年中科院生物物理所饒子和團(tuán)隊(duì)解析了高達(dá)4.1埃的ASFV衣殼結(jié)構(gòu)，包括1個(gè)主要(P72)和4個(gè)次要的衣殼蛋白質(zhì)(M1249L，p17，p49和H240R)，位于衣殼外層的蛋白是五鄰體蛋白(Penton)，位于5次軸的頂點(diǎn)，通過(guò)分子量估算和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，五鄰體蛋白為非洲豬瘟病毒中的H240R蛋白。H240R蛋白有240個(gè)殘基，富含β鏈，呈現(xiàn)1個(gè)單一的膠凍卷曲折疊和約70個(gè)氨基酸的N端延伸，推測(cè)其在ASFV組裝中具有重要作用[14]。同時(shí)，H240R蛋白作為結(jié)構(gòu)蛋白，并且位于頂點(diǎn)，推測(cè)其在宿主體內(nèi)可刺激產(chǎn)生強(qiáng)烈免疫反應(yīng)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究選擇了ASFV BA71V毒株H240R序列(登錄號(hào)：NP_042812.1)為靶序列，通過(guò)密碼子優(yōu)化后，人工合成基因序列，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建重組載體pET28a/H，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。優(yōu)化工程菌株誘導(dǎo)和表達(dá)條件，目的蛋白以包涵體形式表達(dá)。目的蛋白經(jīng)過(guò)包涵體洗滌、親和層析純化和復(fù)性后，H240R蛋白成功復(fù)性，并且可以和陽(yáng)性血清反應(yīng)。目的蛋白和ISA201佐劑乳化后，在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)了抗體產(chǎn)生，抗體在二免后7 d迅速升高，抗體水平持續(xù)時(shí)間較短。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】由于尚未有報(bào)道ASFV衣殼蛋白H240R原核表達(dá)及免疫免疫原性研究，因此本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)可為進(jìn)一步研究H240R蛋白其結(jié)構(gòu)和功能，以及能否誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性應(yīng)答等方面提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、重組質(zhì)粒和主要試劑 大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)和質(zhì)粒pET28a(+)為本實(shí)驗(yàn)室保存；pUC57/H載體(含ASFV H240R基因)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并構(gòu)建；限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ、T4DNA連接酶、DNA Marker(DL5000)購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，PageRulerTMPrestained Protein Ladder(10～180kDa和5～245 kDa)購(gòu)自賽默飛世爾科技公司，Ni-NTA 瓊脂糖純化樹(shù)脂購(gòu)自美國(guó) QIAGEN 公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-Dthiogalactopyranoside，IPTG)干粉、抗His標(biāo)簽抗體購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；卡那霉素(Kan)、咪唑購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；小鼠購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；ASFV陽(yáng)性血清(滅活)由洛陽(yáng)普萊柯生物工程股份有限公司提供；ASFV P72(135～490 aa)原核表達(dá)蛋白由河南省生物工程技術(shù)研究中心提供，其它化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

表1 PCR用到的引物序列

1.1.2 引物 根據(jù)合成并優(yōu)化后ASFV H240R基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的序列引物，上下游引物分別加NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)以及相應(yīng)保護(hù)性堿基，引物見(jiàn)表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 利用 ExPASy 在線分析工具ProtParam(http://web.expasy.org /prot- param/) 分析H240R蛋白的分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成、原子數(shù)、穩(wěn)定疏水性等理化性質(zhì)。利用軟件分析 DNASTAR 軟件中的Protean 模塊，對(duì)H240R 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。使用Swiss-Model(https://swissmodel.expasy.org/)同源建模，預(yù)測(cè)H240R 三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.2 重組載體構(gòu)建 以pUC57/H為模板，引物ASFVH-F/R，擴(kuò)增目的片段。目的片段和質(zhì)粒pET28a(+)分別經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切、回收和連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布卡那霉素抗性平板，37 ℃培養(yǎng)10 h，挑選單克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，菌落PCR、提取質(zhì)粒雙酶切和測(cè)序鑒定正確的質(zhì)粒命為pET28a(+)/H。

1.2.3 目的蛋白表達(dá)和純化 測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET28a(+)/H轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單克隆于含有卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)3～4 h，至OD600nm值為0.5～0.7，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度0.5 mmol/L，小量分別在37 ℃(5 h)、25 ℃(10 h)、16 ℃(20 h)3種不同的溫度下誘導(dǎo)，10 000 r/min，離心10 min收集菌體，pH 8.0，20 mmol/L Tris緩沖液(含50 mmol/L Nacl)A重懸菌體，冰浴條件下超聲破碎，12 000 r/min離心10 min，收集上清和沉淀，SDS-PAGE電泳鑒定。誘導(dǎo)條件確定后，按照最優(yōu)條件大量誘導(dǎo)表達(dá)，超聲破碎菌體，得到包涵體沉淀。

包涵體洗滌緩沖液一(緩沖液A+10 mmol/L EDTA+體積比0.1%的NP-40)重懸包涵體，超聲混勻5 min，12 000 r/min離心10 min，沉淀用包涵體洗滌緩沖液液二(緩沖液A+1 mmol/L EDTA+2 mmol/L尿素)重懸洗滌，12 000 r/min離心10 min，沉淀用緩沖液B(20 mmol/L Tris+50 mmol/L NaCl+8 mmol/L尿素)充分溶解，12 000 r/min離心10 min后，上清可作為親和層析上樣的樣品。含20 mL Ni2+的柱子用5倍柱體積的緩沖液B平衡，直接上樣，流速為2 mL/min，上樣結(jié)束，用含100 mmol/L咪唑的緩沖液B除雜，再用含300 mmol/L咪唑的緩沖液B洗脫目的蛋白。純化蛋白通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分析。

1.2.4 目的蛋白復(fù)性和鑒定 目的蛋白復(fù)性：利用梯度透析復(fù)性目的蛋白，將20 mL含8 mmol/L尿素的目的蛋白裝入透析袋(截留分子量10 KDa)，依次用含6 mmol/L尿素+10%甘油、4 mmol/L尿素+10%甘油、3 mmol/L尿素+10%甘油、2 mmol/L尿素+5%甘油、1 mmol/L尿素+5%甘油的緩沖液A，進(jìn)行透析。最后用緩沖液A透析。透析后蛋白12 000 r/min離心10 min后，上清用超濾管(截留分子量3 KDa)濃縮，濃縮至0.8 mg/mL，0.22 μm無(wú)菌針頭濾器過(guò)濾后，分裝-20 ℃保存待用。

免疫印跡：將復(fù)性的H240R蛋白SDS-PAGE 電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜，用含5%脫脂奶粉的PBST溶液 37 ℃封閉 2 h，PBST 洗滌3次，每次 5 min，用抗His標(biāo)簽抗體作為一抗37 ℃孵育 2 h，PBST 洗滌3次，使用 HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(1∶4000) 37 ℃孵育1 h，PBST 洗滌3次，最后用 DAB 顯色；斑點(diǎn)-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Dot-ELISA)：將復(fù)性的蛋白每次3 μL加在NC膜中央，ASFV P 72蛋白(145～490aa)組為陽(yáng)性對(duì)照，未誘導(dǎo)大腸桿菌BL21(DE3)菌體裂解物為陰性，自然風(fēng)干后，再次滴加，共3次，用含5%脫脂奶粉的PBST溶液 37 ℃封閉2 h，PBST 洗滌3次，用ASFV陽(yáng)性血清(滅活)作為一抗37 ℃孵育2 h，PBST 洗滌3次，使用 HRP 標(biāo)記的兔抗豬二抗(1∶2000) 37 ℃孵育 1 h，PBST 洗3次，最后顯色。

1.2.5 目的蛋白在小鼠體內(nèi)刺激產(chǎn)生抗體檢測(cè) 隨機(jī)將15只昆明鼠分為3組，陰性組(PBS)和實(shí)驗(yàn)組(25和50 μg)，每組5只。陰性對(duì)照組用PBS和佐劑(ISA 201)乳化制備，實(shí)驗(yàn)組用25和50 μg復(fù)性蛋白和佐劑(ISA 201)乳化制備，制備好的疫苗于昆明鼠背部皮下多點(diǎn)免疫，免疫兩次，間隔14 d，免疫兩次，0和14 d各免疫1次。分別在免疫前(0)、7、14、21、28、35和42 d小鼠尾靜脈采血。全血37 ℃放置2 h，4 ℃ 靜置4 h， 4000 r/min離心7 min，分離血清-20 ℃待用。用間接ELISA檢測(cè)抗體水平及消長(zhǎng)規(guī)律，用碳酸緩沖液(pH 9.6)稀釋復(fù)性蛋白，100 ng/孔4 ℃包被過(guò)夜(12 h)，棄去包被液，用含5%脫脂奶粉的PBST溶液 37 ℃封閉 2 h，250 μL/孔，棄去封閉液，100 μL/孔加入待測(cè)血清(1/100稀釋)，設(shè)置空白對(duì)照和陰性對(duì)照，37 ℃溫育30 min，PBST 洗滌5次，加入HRP 標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶8000) 37 ℃溫育30 min，PBST 洗滌5次，加入顯色劑A(H2O2)和顯色劑B(TMB)37 ℃溫育10 min，2 mol/L 硫酸終止，酶標(biāo)儀讀數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ASFV H240R蛋白組成、理化性質(zhì)及抗原表位等生物信息學(xué)分析

ExPASy 在線分析工具顯示，H240R蛋白由 240個(gè)氨基酸組成，蛋白分子質(zhì)量為27.7 KDa；等電點(diǎn)為9.40，原子組不穩(wěn)定系數(shù)為 44.28，平均親水系數(shù)為-0.086，為不穩(wěn)定性親水蛋白，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。 DNASTAR 軟件預(yù)測(cè)H240R蛋白表位，有13個(gè)抗原表位，抗原指數(shù)高(圖1-a)。通過(guò)Swiss-Model同源建模，得到3個(gè)模型，其中與已知T4噬菌體內(nèi)切核糖核酸酶結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)(第86～188位氨基酸殘基)，預(yù)測(cè)所得H240R蛋白第86～188位氨基酸的蛋白結(jié)構(gòu)，由多個(gè)α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)組成(圖1-b)。

2.2 重組載體構(gòu)建、鑒定和目的蛋白表達(dá)

PCR擴(kuò)增H240R基因片段，與原核表達(dá)載體 pET-28a(+)雙酶切后，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a(+)/H，質(zhì)粒利用雙酶切(圖2-b)和測(cè)序進(jìn)行鑒定。表達(dá)菌株BL21(DE3) /pET28a(+)/H分別在37 ℃(5 h)、25 ℃(10 h)、16 ℃(20 h)3種不同的溫度，0.5 mmol/L IPTG下誘導(dǎo)表達(dá)，目的蛋白始終以包涵體形式表達(dá)(圖2-c)，確定誘導(dǎo)表達(dá)條件為：0.5 mmol/L IPTG，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)5 h。

2.3 目的蛋白純化和復(fù)性

工程菌株BL(DE3) /pET28a(+)/H在0.5 mmol/L IPTG，37 ℃條件下，大量誘導(dǎo)。超聲破碎離心后的包涵體蛋白經(jīng)過(guò)洗滌緩沖液洗滌和親和層析，得到純化的目的蛋白(圖3)。純化的變性蛋白采用梯度透析進(jìn)行復(fù)性，約有60%蛋白成功復(fù)性。

2.4 目的蛋白鑒定

純化的目的蛋白通過(guò)Wstern和DOT-ELISA進(jìn)行鑒定。Wstern結(jié)果顯示：復(fù)性的H240R蛋白可以抗His抗體反應(yīng)，大小在33 KDa左右，與預(yù)期大小相符(圖4-a)。從DOT-ELISA結(jié)果可以看出復(fù)性的目的蛋白以及ASFV P72(135～490 aa)原核重組蛋白可以和兩份陽(yáng)性血清反應(yīng)，且復(fù)性的H240R和陽(yáng)性血清反應(yīng)顯色明顯高于ASFV P72(135～490 aa)重組蛋白，表明復(fù)性的H240R蛋白具有很好的免疫反應(yīng)性(圖4-b)。

2.5 目的蛋白在小鼠體內(nèi)刺激產(chǎn)生抗體消長(zhǎng)規(guī)律

取0、7、14、21、28、35和42 d小鼠血清，PBS稀釋后(1/100)，用復(fù)性H240R蛋白包被的酶標(biāo)板，通過(guò)間接ELISA檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示：第一次免疫14 d，試驗(yàn)組不同劑量(25和50 μg)免疫的小鼠均產(chǎn)生了抗體，二免后7 d(一免后21 d)，抗體迅速升高，50 μg免疫小鼠抗體水平高于25 μg，二免后14 d均達(dá)到平臺(tái)期，不同劑量之間抗體水平?jīng)]有顯著差異，二免后21 d抗體水平開(kāi)始下降(圖5)?？贵w水平消長(zhǎng)情況說(shuō)明復(fù)性的H240R具有很好的免疫原性，可以在小鼠體內(nèi)刺激產(chǎn)生高水平的抗體。

3 討 論

ASFV會(huì)導(dǎo)致家豬和野豬的高發(fā)病率和死亡率，對(duì)兩者都具有毀滅性打擊，且在經(jīng)濟(jì)上具有重大意義的一種疾病，目前世界范圍內(nèi)沒(méi)有可用的疫苗，控制方法仍為在受影響的地區(qū)進(jìn)行地區(qū)隔離和動(dòng)物撲殺。自2018年ASFV傳入我國(guó)以來(lái)，給我國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)造成巨大損失，這2年間，我國(guó)ASFV的防控取得了階段性成果，疫情發(fā)生強(qiáng)度和數(shù)量均呈下降趨勢(shì)，關(guān)鍵環(huán)節(jié)病毒污染情況得到改善，養(yǎng)殖戶生物安全意識(shí)明顯提高。由于我國(guó)生豬養(yǎng)殖體量大，中小養(yǎng)殖戶多，養(yǎng)殖環(huán)境復(fù)雜，防控形式仍很?chē)?yán)峻，也出現(xiàn)了新情況：境外疫情輸入風(fēng)險(xiǎn)持續(xù)存在；病毒分布依然很廣，傳播途徑難以完全阻斷，防控工作存在薄弱環(huán)節(jié)，生豬販運(yùn)活動(dòng)難監(jiān)管；病毒已在部分野豬群中定殖，根除難度進(jìn)一步加大[17-18]。針對(duì)ASFV防控新形勢(shì)，我國(guó)農(nóng)村農(nóng)業(yè)部調(diào)整防控策略，于2020年8月印發(fā)《非洲豬瘟常態(tài)化防控技術(shù)指南(試行版)》的通知，建立了常態(tài)化防控機(jī)制。雖然這些措施對(duì)目前ASFV防控很有必要，但從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，控制疫情，穩(wěn)定生豬生產(chǎn)，甚至根除ASFV，還是需要疫苗來(lái)完成。因此，包括我國(guó)在內(nèi)的世界其他國(guó)家，對(duì)ASF疫苗和抗ASFV藥物有著強(qiáng)烈的市場(chǎng)需求。

ASFV基因組十分龐大，迄今為止，已經(jīng)確定了11個(gè)完整的ASFV基因組序列，開(kāi)放閱讀框的數(shù)量因分離株而異。開(kāi)放閱讀框編碼超過(guò)200多種蛋白，發(fā)現(xiàn)編碼結(jié)構(gòu)蛋白就有60多種，其中很多結(jié)構(gòu)蛋白參與基因組復(fù)制和病毒感染，以及逃避宿主的防御系統(tǒng)。如pp220、pp62、p72、p54、p30、CD2v、p10、p12、p14.5和p17。pp220和pp62是ASFV多聚蛋白前體，都屬于晚期感染蛋白，這些前體蛋白可被蛋白水解酶切割成成熟的病毒體蛋白(p150、p37、p14、p34、p35和p15)，成熟蛋白在病毒衣殼的組裝過(guò)程中起關(guān)鍵作用。ASFV p54和p30是非常重要的抗原結(jié)構(gòu)蛋白，P54 是 ASFV 表達(dá)的早期膜蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為是主要的毒力蛋白之一，同時(shí)也介導(dǎo)ASFV在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)[19-20]；P30在感染后 2～4 h 產(chǎn)生，在病毒DNA合成開(kāi)始之前就已經(jīng)產(chǎn)生并持續(xù)表達(dá)至病毒生命周期的結(jié)束，整個(gè)感染期間均持續(xù)表達(dá)，與病毒入侵宿主細(xì)胞有關(guān)，主要有參與病毒內(nèi)化的功能，p30產(chǎn)生的抗體可阻止病毒內(nèi)吞[21-22]。p72是病毒衣殼二十面體的主要成分，約占病毒蛋白總量的30%左右，具有高度的免疫原性，在病毒感染后期的病毒衣殼形成中非常重要[23-24]。CD2v是 ASFV 外膜蛋白中唯一特征性病毒糖蛋白，類似于 T 淋巴細(xì)胞表面粘附受體 CD2，具有吸附紅細(xì)胞的特性，該蛋白能夠識(shí)別宿主細(xì)胞的膜蛋白并與之結(jié)合，幫助病毒粒子吸附在宿主細(xì)胞表面和侵入細(xì)胞[25-26]。然而，由于ASFV基因編碼的絕大多數(shù)蛋白功能及作用機(jī)制并不清楚，對(duì)其結(jié)構(gòu)蛋白、病毒組裝以及針對(duì)ASFV的抑制基因、逃逸相關(guān)蛋白、感染調(diào)節(jié)因子、天然免疫應(yīng)答、有效抗體等的研究欠缺，近乎空白，這限制了ASFV復(fù)制相關(guān)蛋白和毒力相關(guān)蛋白的了解，以及相關(guān)疫苗的研制。2019年10月，我國(guó)首次解析了非洲豬瘟病毒全顆粒的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)ASFV的衣殼結(jié)構(gòu)包括一個(gè)主要衣殼蛋白質(zhì)(p72)和4個(gè)次要衣殼蛋白質(zhì)(M1249L、p17、p49和H240R)，其中位于5次軸的頂點(diǎn)的H240R蛋白是ASFV的一個(gè)重要蛋白，但其詳細(xì)結(jié)構(gòu)和功能以及是否能刺激宿主產(chǎn)生中和抗體仍不清楚[14]。

本實(shí)驗(yàn)中，H240R蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中，始終以包涵體形式表達(dá)。目的蛋白在透析復(fù)性時(shí)，從含8 mmol/L尿素的緩沖液降低到4 mmol/L時(shí)，可很快進(jìn)行，不會(huì)產(chǎn)生蛋白析出，而4 mmol/L尿素減低到3 mmol/L時(shí)，蛋白極易析出，透析時(shí)間要長(zhǎng)，尿素透析濃度下降速度要緩慢。同時(shí)，復(fù)性的H240R蛋白和佐劑ISA201乳化后免疫小鼠，抗體水平達(dá)到平臺(tái)期后，維持時(shí)間較短，是蛋白自身原因，還是蛋白和ISA201佐劑不是最佳配伍，需要進(jìn)一步研究。ASFV冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析推測(cè)H240R蛋白在病毒組裝有重要作用，其具體作用機(jī)制以及其它功能仍未知，雖然H240R蛋白在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，但這些抗體是否含有中和抗體，能否產(chǎn)生中和保護(hù)也需要進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)人工合成了H240R全基因序列，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白，其以包涵體形式存在。目的蛋白通過(guò)親和層析純化，利用梯度透析進(jìn)行復(fù)性，復(fù)性后的H240R蛋白和P72(135～490 aa)蛋白以相同濃度點(diǎn)樣做DOT-ELISA，結(jié)果顯示兩者均可以和陽(yáng)性血清反應(yīng)，H240R蛋白顯色程度更強(qiáng)。同時(shí)，H240R蛋白免疫小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生了強(qiáng)的抗體水平，這些表明H240R蛋白具有較好的免疫原性和免疫反應(yīng)性?？傊?，H240R蛋白是ASFV一個(gè)重要結(jié)構(gòu)蛋白，對(duì)其功能進(jìn)行詳細(xì)和全面研究，以期能更好了解ASFV的組裝、入侵宿主、以及亞單位疫苗研制提供思路。