陳 美，鐘金城，武志娟，王吉坤，柴志欣

(西南民族大學青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省重點實驗室，四川 成都 610041)

【研究意義】牦牛(Bosgrunniens)別名旄牛，素有“高原之舟”之稱，是世界上唯一能在高海拔地區(qū)低氧、寒冷等極度惡劣氣候環(huán)境中生存的大型反芻家畜[1-2]。麥洼牦牛是青藏高原型牦牛的地方良種，主要產(chǎn)于四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣瓦切、麥洼及若爾蓋縣包座一帶，其肉乳兼用[3]，是當?shù)剞r(nóng)牧民的主要經(jīng)濟畜種，可提供肉、乳、毛絨、燃料和役力等生活生產(chǎn)必需品[4]。X染色體相關(guān)小肌肉蛋白(small muscle protein X-link，SMPX)于1999年首次在人類基因組中發(fā)現(xiàn)，定位于染色體Xp22，共編碼88個氨基酸，是一種與細胞骨架相關(guān)的蛋白，在心肌和骨骼肌以及胎兒內(nèi)耳中均高度表達[5-8]。【前人研究進展】Ren等[9]對豬SMPX基因進行克隆和鑒定發(fā)現(xiàn)，該蛋白編碼一個核位置信號肽，兩個重疊的酪蛋白激酶II磷酸化位點和一個N-糖基化位點，RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)該基因主要在骨骼肌和心肌中表達，而在其它組織中的表達水平中等，推測SMPX基因在骨骼肌和心肌的發(fā)育過程中發(fā)揮作用。Aaron等[7]發(fā)現(xiàn)X連鎖基因Chisel(Csl/Smpx)所編碼的9 kDa蛋白質(zhì)在心臟和骨骼肌細胞中與肋骨的細胞骨架相關(guān)聯(lián)，并與維持肌肉完整性有關(guān)。鄧瑞強[10]對豬SMPX基因在胚胎期30、60 d和成年期的背腰最長肌表達水平變化進行檢測，發(fā)現(xiàn)該基因在化胎期60 d背腰最長肌的表達量約為胚胎期30 d和成年期的14倍。官紅平[11]通對豬SMPX基因進行SNPs檢測，發(fā)現(xiàn)SMPX基因3′ UTR存在A-G突變，且發(fā)現(xiàn)該位點的基因型頻率在不同品種中存在較大差異。以上研究表明，SMPX基因在骨骼肌肉發(fā)育的過程中起調(diào)節(jié)作用?！颈狙芯壳腥朦c】本研究對麥洼牦牛SMPX基因進行多態(tài)性檢測及關(guān)聯(lián)性分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】此結(jié)果以期為育種工作中提高牦牛生長性能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于四川省阿壩藏區(qū)羌族自治州紅原縣龍日種畜場選取89頭健康成年的麥洼牦牛，其中黑嘴麥洼牦牛(43頭)和粉嘴麥洼牦牛(46頭)，采集其耳組織樣品，75%乙醇保存帶回實驗室，將樣品置于新離心管中-80 ℃保存?zhèn)溆?，同時測量牦牛的體重、體高、體斜長、胸圍、管圍等生長性狀數(shù)據(jù)。

1.2 引物試劑與合成

根據(jù)GenBank中黃牛SPMX基因序列(NW_005393903.1)，利用Primer 5對SPMX基因3個外顯子及啟動子區(qū)域設(shè)計特異性引物(表1)。引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 SPMX基因PCR擴增

根據(jù)動物組織基因組DNA提取試劑盒(TianGen生物技術(shù)有限公司)提取基因組DNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。選取10頭牦牛個體，每個體取模板DNA 1 μL，構(gòu)建DNA混合池，配至50 μL。

PCR擴增體系(25 μL)：2×TaqGreen PCRMasterMix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，最后加入7.5 μL ddH2O配至25 μL。擴增條件：預變性(95 ℃ 5 min)，變性(95 ℃ 30 s)，退火溫度55 ℃，延伸時間(72 ℃150 s)，35個循環(huán)，延伸(72 ℃10 min)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用MEGE 5、BLAST在線軟件進行測序結(jié)果比對，SPSS 19.0 軟件計算SMPX基因多態(tài)位點在試驗群體中的基因雜合度、純合度、多態(tài)信息含量、有效等位基因數(shù)和χ2獨立性檢測，以及該基因不同基因型與生長發(fā)育性狀的關(guān)系，結(jié)果用平均數(shù)±標準誤表示。Independent sample t-test進行差異顯著性分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增

以牦牛耳組織DNA為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰，結(jié)果與目的條帶一致，SMPX基因外顯子擴增長度分別為189、193 和450 bp，啟動子長度為2181 bp(圖1)。

表1 引物序列

2.2 SNP篩選與分析

將麥洼牦牛SMPX基因測序結(jié)果與普通牛該基因序列(NW_005393903.1)比對，在麥洼牦牛SMPX基因外顯子區(qū)域未檢測到SNPs，啟動子區(qū)域存在2個突變位點，分別為G532A 和C1481G，G532A位點存在GG、GA和AA型3種基因型；C1481G位點3種基因型包括CC、CG和GG型3種基因型(圖2)。

2.3 基因型頻率及基因頻率

對測序結(jié)果統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，純黑麥洼牦牛和粉嘴麥洼牦牛在G532A位點中均存在GG、GA和AA 3種基因型，其GG型的基因型頻率最高，分別達到0.721和0.761，說明2個類群中GG型屬于優(yōu)勢基因型，等位基因G為優(yōu)勢等位基因。C1481G位點在2個群體中，CC基因型頻率分別為0.605和0.457，等位基因C頻率為0.791和0.664，說明在2個群體中CC型均為優(yōu)勢基因型，等位基因C均為優(yōu)勢等位基因(表2)。

表2 SMPX基因的基因型頻率和基因頻率

2.4 遺傳多態(tài)性分析

由表3可知，G532A 和C1481G位點在粉嘴和黑嘴2個類群中的多態(tài)信息含量(PIC)分別為0.2570、0.2647、0.3084和0.3470(0.250.05，均符合Hardy-Weinberg平衡。

2.5 SMPX基因與牦牛生長性狀的關(guān)聯(lián)性分析

利用SPSS 19.0軟件對麥洼牦牛SMPX基因突變位點不同基因型與其生長性狀進行差異顯著性檢驗，發(fā)現(xiàn)在G532A位點中，除純黑麥洼牦牛GG型個體體高顯著高于AA型個體外(P<0.05)，其它各基因型對牦牛生長性狀無顯著性影響(P>0.05)；而在C1481G位點中，純黑麥洼牦牛和粉嘴麥洼牦牛的不同基因型間與其生長性狀差異均不顯著(P>0.05， 表4)。

3 討 論

SMPX基因與肌肉的生長發(fā)育相關(guān)，在人體中SMPX基因可被肌肉調(diào)節(jié)因子所調(diào)控，且該基因總長度為50 kb，包含5個外顯子和4個內(nèi)含子，且在心臟和骨骼肌中大量表達[10-13]。目前，關(guān)于SMPX基因的研究主要集中在人[14-16]的聽力損失疾病方面，而關(guān)于肌肉發(fā)育規(guī)律方面的研究相對較少。有研究報道，SMPX已有5個突變被證明與人的X連鎖顯性聽力損失有關(guān)，其家系均存在表型差異現(xiàn)象[17]；Aaron等[7]發(fā)現(xiàn)豬SMPX基因的5′ 和3′ 非編碼區(qū)存在2個SNPs位點，且該基因在啟動子上游區(qū)存在MEF2、MyoD和Nkx2.53個結(jié)合位點及氨基酸序列中存在2個CK2磷酸化位點[11]。Bai等[18]發(fā)現(xiàn)在豬不同表型的肌肉(紅肌與白肌)中，BC005948顯著差異表達，且在紅肌中高表達，推測其與CK2信號通路相關(guān)，而CK2主要參與細胞生長、增殖及促進肌細胞的發(fā)育，對肌細胞的發(fā)育起正控制作用[19]。Kemp等[20]研究發(fā)現(xiàn)強運動量的小鼠在引起肌細胞肥大的同時，SMPXmRNA表達量顯著升高，推測此基因參與肌細胞肥大的過程，且在篩選NKX-2的靶基因時，發(fā)現(xiàn)SMPX基因在IGF-1同時存在的情況下，在C2C12肌細胞中SMPX過表達可增強肌細胞融合[21]。

表3 SMPX基因的群體遺傳特性

表4 麥洼牦牛SMPX基因?qū)w尺性狀的影響

本試驗在純黑麥洼牦牛和粉嘴麥洼牦牛2個群體的SMPX基因啟動子區(qū)域共檢測到G532A和C1481G 2個SNP位點，在外顯子區(qū)未發(fā)現(xiàn)突變位點。在G532A位點中，這2個群體的優(yōu)勢基因型均為GG型，優(yōu)勢等位基因均為G；而在C1481G位點中，兩者的優(yōu)勢基因型均為CC型，優(yōu)勢等位基因均為C，這一結(jié)果與Aaron[7]、管紅平[11]對豬SMPX基因的SNP位點研究結(jié)果存在差異，因不同物種遺傳結(jié)構(gòu)及生存環(huán)境均存在差異，可能導致其基因序列及突變位點存在一定差異。這2個突變位點的多態(tài)信息含量均為中度多態(tài)，說明麥洼牦牛遺傳變異程度較大，多態(tài)性較豐富。G532A和C1481G位點在純黑和粉嘴麥洼牦牛中的純合度均大于雜合度，說明這兩個位點的純合基因型積累較多，且遺傳變異較小，建議應(yīng)可適當與其他牦牛品種進行基因交流。

通過對SMPX基因G532A和C1481G位點不同基因型與牦牛生長性狀進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明，在G532A位點中，僅純黑麥洼牦牛的GG基因型個體體高顯著高于AA基因型個體，該位點可作為影響牦牛體高的分子標記；而在C1481G位點上，不同基因型與其生長性狀不相關(guān)，可能是麥洼牦牛有進行人工選育造成的結(jié)果。目前該基因在多態(tài)性方面的研究較少，缺少可供參考的數(shù)據(jù)，麥洼SMPX基因的G532A位點可作為影響其生長發(fā)育性狀的分子標記，可用于麥洼牦牛分子育種。

4 結(jié) 論

本研究獲得了麥洼牦牛SMPX基因的多態(tài)信息，并在該基因的啟動子區(qū)域檢測到2個SNP位點，分別為G532A和C1481G，且SMPX基因G532A位點與麥洼牦牛體高顯著相關(guān)。