番華彩，魏 薇，曾 莉*，徐勝濤，李 舒，郭志祥，鄭泗軍

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，云南 昆明 650205；2.昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院/云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650214)

【研究意義】香蕉枯萎病是一種毀滅性的土傳真菌病害，俗稱(chēng)香蕉黃葉病或巴拿馬病，由尖孢鐮刀菌古巴專(zhuān)化型 (Fusariumoxysporumf.sp.cubense) 侵染導(dǎo)致維管束壞死，造成香蕉的減產(chǎn)或絕收[1-3]。香蕉產(chǎn)業(yè)是云南的支柱性產(chǎn)業(yè)，是大邊疆、少數(shù)民族農(nóng)民增收致富的重要途徑[4]。2009年，香蕉枯萎病在云南首次發(fā)現(xiàn)，目前在云南各香蕉主產(chǎn)區(qū)均有不同程度地發(fā)生，已嚴(yán)重威脅云南香蕉產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】作物土傳病害的發(fā)生主要是由于土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)變化引起[6]，土壤中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)組成直接影響細(xì)菌的功能多樣性，并影響土傳病害的發(fā)生和發(fā)展[7-9]。關(guān)于香蕉枯萎病在土壤微生物類(lèi)群方面的研究主要集中于不同香蕉品種、輪連作及拮抗菌施用對(duì)植株根際微生物類(lèi)群的影響等方面[10-16]。云南香蕉在根際土壤細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)方面的研究，特別是香蕉枯萎病和健康植株的根際土壤細(xì)菌群落差異對(duì)比尚未見(jiàn)報(bào)道。【本研究切入點(diǎn)】選取2種類(lèi)型的香蕉植株根際土壤，研究香蕉枯萎病感病植株與健康植株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性及其差異，探索微生物群落結(jié)構(gòu)與香蕉枯萎病之間的關(guān)系?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究明確香蕉枯萎病與健康植株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成豐度及差異，探索香蕉枯萎病發(fā)生的微生態(tài)機(jī)制，優(yōu)化根際土壤微生物微群落結(jié)構(gòu)，為其香蕉枯萎病的后續(xù)生態(tài)防控提供新策略。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

云南省玉溪市元江縣屬于干熱河谷紅河流域，氣候類(lèi)型為低緯度高原亞熱帶季風(fēng)氣候，最高海拔2580 m，最低海拔327 m，年平均氣溫23.8 ℃，終年無(wú)霜。選擇元江縣香蕉種植基地(北緯23°35'19″N，101°59′29″E，海拔為380 m)進(jìn)行樣品采集，基地土壤為磚紅壤沙質(zhì)土，種植香蕉品種為桂蕉，生育期為抽蕾期；在香蕉枯萎發(fā)病率約為5%～8%的地塊，分別采集香蕉枯萎病(FB)和健康(CK)2種類(lèi)型香蕉植株根際土壤。

2018 年 11月使用5點(diǎn)取樣法隨機(jī)采集香蕉枯萎病(FB)和健康(CK)植株根際土壤樣品，每個(gè)處理5次重復(fù)，用土壤采集器采集0～10 cm 土壤，收集附著在根系上的土壤作為根際土壤，混勻后用聚乙烯無(wú)菌袋密封(自封袋)置于冰盒中立即帶回實(shí)驗(yàn)室，撿出根須、石子等雜質(zhì)，得到5份香蕉枯萎病植株根際土壤樣品(FB:YJA，YJC，YJEA，YJEB，YJEC)，5份健康植株根際土壤樣品(CK:YJH，YJI，YJLA，YJLB，YJLC)，共計(jì)10份土壤樣品，置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 土壤微生物基因組DNA提取及檢測(cè)

參照FastDNA SPIN Kit for soil試劑盒(MP Biomedicals，美國(guó))的使用方法，對(duì)土壤樣品提取總DNA。使用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000 (Thermo Scientific，美國(guó)) 檢測(cè)土壤樣品總DNA濃度與純度后置于-20 ℃冰箱保存。

1.3 PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

利用通用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對(duì)細(xì)菌的16 S rRNA進(jìn)行V3～V4區(qū)的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海美吉生物科技有限公司在Illumina Miseq平臺(tái)上進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

運(yùn)用QIIME(Uparse)8.0軟件對(duì)Illumina Miseq測(cè)序所得原始數(shù)據(jù)進(jìn)行擴(kuò)增序列處理，在97%相似性水平上進(jìn)行OTUs[17]分類(lèi)(Operational taxonomic units) 劃分，根據(jù)樣本間Unifrac距離矩陣進(jìn)行主坐標(biāo)分析 (PCoA)[18]，采用R的pheatmap package[19]繪制熱圖。使用多變量方差分析(PERMANOVA)通過(guò) R(v.3.2.5)中的程序包(v.2.3-5)測(cè)試樣本間的差異。通過(guò)t-test 檢驗(yàn)樣本間的顯著性，并使用單因素方差分析(ANOVA)獲得多組的顯著性。使用Mothur軟件，對(duì)門(mén)和屬水平上的細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行Lefse分析(P< 0.05)。運(yùn)用R軟件分析各樣本 (組) OTU 數(shù)量，并通過(guò) Venn 圖呈現(xiàn)各樣本 (組) OTU比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析

通過(guò)對(duì)香蕉枯萎病(FB)和健康(CK)植株根際土壤的10個(gè)樣品進(jìn)行16 S rRNA 基因的 V3～V4 區(qū)擴(kuò)增測(cè)序，共得到420 084條有效序列。香蕉枯萎病和健康植株根際土壤中包含的 OTU 數(shù)目分別是3432和2988個(gè)。根據(jù)各樣本 (組) 的 OUT數(shù)目，通過(guò)Venn 圖呈現(xiàn)香蕉枯萎病和健康植株樣品的 OTU數(shù)目組成比例(圖 1)，香蕉枯萎病和健康植株共有2854個(gè)OTU，發(fā)病組特有的有578個(gè)，對(duì)照組特有的有134個(gè)，其余為樣品間兩兩共有。通過(guò)隨機(jī)抽樣的序列數(shù)與其對(duì)應(yīng)的 OTU 數(shù)目構(gòu)建香蕉枯萎病和健康植株根際土壤的細(xì)菌稀釋曲線(xiàn)(圖2)， 10個(gè)香蕉植株根際土壤樣品的稀釋曲線(xiàn)平緩， 2種類(lèi)型香蕉植株根際土壤樣品取樣合理，根際土壤樣品的細(xì)菌群落能夠得到體現(xiàn)。

2.2 土壤細(xì)菌群落α多樣性分析

通過(guò)細(xì)菌群落α多樣性分析，比較香蕉枯萎病和健康植株的土壤細(xì)菌多樣性差異。香蕉枯萎病植株的Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)較健康植株的高，香蕉枯萎病植株細(xì)菌多樣性較豐富，香蕉枯萎病植株和健康植株的細(xì)菌α多樣性差異顯著(P<0.05)；在均勻度上，香蕉枯萎病植株根際土壤細(xì)菌的Shannon 指數(shù)高于健康植株，而Simpson 指數(shù)低于健康植株，差異顯著。

2.3 香蕉植株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成

通過(guò)使用QIIME 軟件對(duì)10個(gè)香蕉植株根際土壤樣品進(jìn)行分析，門(mén)水平上，共有 34 個(gè)細(xì)菌類(lèi)群，其中11個(gè)最大豐度的物種豐度柱形圖(圖3)表明，變形菌門(mén) (Proteobacteria)為優(yōu)勢(shì)菌群，占細(xì)菌總數(shù)的 31.0%～46.5%，其它優(yōu)勢(shì)菌群依次為厚壁菌門(mén)(Firmicutes, 12.8%～22.6%)，放線(xiàn)菌門(mén) (Actinobacteria, 9.9%～19.8%)，酸桿菌門(mén) (Acidobacteria, 3.6%～12.2%)，綠彎菌門(mén) (Chloroflexi, 4.1%～10.3%)，芽單胞菌門(mén) (Gemmatimonadetes, 3.5%～5.9%)，髕骨細(xì)菌 (Patescibacteria, 1.4%～2.1%)，擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes, 1.1%～2.0%)，棒狀桿菌 (Rokubacteria, 0.1%～2.4%)。優(yōu)勢(shì)門(mén)菌群中，厚壁菌門(mén)豐度健康植株較發(fā)病植株高，棒狀桿菌豐度發(fā)病植株較健康植株高。屬水平上，共有 513個(gè)細(xì)菌類(lèi)群，豐度排名前 18的物種相對(duì)豐度柱形圖見(jiàn)圖4，香蕉枯萎病與健康植株的細(xì)菌群落組成有一定同源性，但細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及豐度組成差異明顯。芽胞桿菌屬 (Bacillus, 9.5%)、芽單胞菌屬 (Gemmatimonadaceae, 4.0%)、鞘脂單胞菌屬 (Sphingomonas, 3.6%)和朱氏桿菌屬 (Chujaibacter, 2.7%)為香蕉枯萎病植株根際土壤中的優(yōu)勢(shì)屬。健康植株根際土壤中的優(yōu)勢(shì)屬為芽胞桿菌屬 (Bacillus, 16.6%)、朱氏桿菌 (Chujaibacter, 8.1%)、芽單胞菌屬 (Gemmatimonadaceae, 3.0%)和鞘脂單胞菌屬 (Sphingomonas, 2.2%)。優(yōu)勢(shì)屬菌群中，芽胞桿菌屬、朱氏桿菌屬的豐度健康植株明顯高于枯萎病植株，而芽單胞菌屬和鞘脂單胞菌屬的豐度比率低于枯萎病植株。

2.4 細(xì)菌菌群群落組成聚類(lèi)分析

在屬水平上，使用 R 軟件，對(duì)于10個(gè)樣品中豐度前50的細(xì)菌菌群繪制了Heatmap 熱圖聚類(lèi)分析，分析了香蕉枯萎病和健康植株的根際土壤細(xì)菌群落的聚類(lèi)熱圖(圖5)。10個(gè)樣品的細(xì)菌群落組成聚類(lèi)為2個(gè)大的分支，香蕉枯萎病植株5個(gè)樣品和健康植株的5個(gè)樣品基本各為1個(gè)分支，香蕉枯萎病和健康植株的細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)有明顯差異。芽胞桿菌屬(Bacillus)在香蕉植株根際土壤中均為優(yōu)勢(shì)菌群，豐度大小健康香蕉植株(CK)>香蕉枯萎病植株 (FB)；朱氏桿菌屬 (Chujaibacter)在健康香蕉植株根際土壤中為優(yōu)勢(shì)菌群，芽單胞菌屬(Gemmatimonadaceae) 在發(fā)病香蕉植株根際土壤中為優(yōu)勢(shì)菌群。為了觀察微生物群落結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)行了PCA分析(圖6)，從主坐標(biāo)分析 (PCA) 圖可看出，香蕉植株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成有明顯變化，香蕉枯萎病和健康植株的細(xì)菌群落組成分離明顯，健康香蕉植株的細(xì)菌群落在右邊的軸上與香蕉枯萎病植株細(xì)菌群落能明顯區(qū)分開(kāi)，差別突顯，同組的土壤樣品具有相似的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

2.5 細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)差異分析

為進(jìn)一步分析香蕉枯萎病和健康植株的細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)差異，使用Mothur軟件，對(duì)門(mén)和屬水平上最大豐度前20的細(xì)菌菌群進(jìn)行了Lefse分析(P<0.05)。從圖7可以看出，門(mén)水平上(圖7-A)，在香蕉根際土壤中最大豐度前20的細(xì)菌菌群中，香蕉枯萎病和健康植株的細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)有5個(gè)門(mén)差異顯著，根據(jù)豐度大小依次為厚壁菌門(mén) (Firmicutes)，棒狀桿菌門(mén) (Rokubacteria)，硝化螺旋菌門(mén) (Nitrospirae)，Latescibacteria和Dadabacteria。厚壁菌門(mén)在健康植株中的豐度比例較高，但棒狀桿菌、硝化螺旋菌門(mén)豐度比率低于枯萎病植株；屬水平上(圖7-B)，芽胞桿菌屬 (Bacillus)，朱氏桿菌屬 (Chujaibacter)，土壤鏈霉菌屬 (Streptomyces)，伴伯克氏菌屬 (Paraburkholderia)和Rokubacteriales等5個(gè)屬的組成結(jié)構(gòu)在香蕉枯萎病和健康植株中差異顯著。芽胞桿菌屬 (Bacillus)、朱氏桿菌屬 (Chujaibacter)、土壤鏈霉菌屬 (Streptomyces)和伴伯克氏菌屬 (Paraburkholderia)在健康植株中的豐度比例高于香蕉枯萎病植株。

3 討 論

生態(tài)系統(tǒng)中的微生物多樣性豐富，在大自然的生物多樣性中具有重要的生態(tài)功能[20]，土傳病害的發(fā)生與植株根際土壤微生物數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系[6]，土傳病原菌作為土壤微生物的一種，其種群必然受到土壤微生物多樣性的影響。研究結(jié)果表明,香蕉枯萎病和健康植株根際土壤細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)和組成差異顯著，土壤細(xì)菌多樣性香蕉枯萎病植株高于健康植株，陳波等研究也有相同結(jié)果[21]，但與歐陽(yáng)嫻[13]、林威鵬[14]等報(bào)道不一致，這可能與香蕉種植區(qū)域有關(guān)。變形菌門(mén) (Proteobacteria)、厚壁菌門(mén) (Firmicutes)、放線(xiàn)菌門(mén) (Actinobacteria)和酸桿菌門(mén) (Acidobacteria)等為香蕉植株根際土壤中的主要優(yōu)勢(shì)門(mén)菌群，黃珍[12]、周登博[15]、沈宗專(zhuān)[16]、Janssen[22]也有相同的研究結(jié)果。研究認(rèn)為，屬水平上，香蕉枯萎病和健康植株的根際土壤中有5個(gè)菌群差異顯著，依次為芽胞桿菌屬 (Bacillus)，朱氏桿菌屬 (Chujaibacter)，土壤鏈霉菌屬 (Streptomyces)，伴伯克氏菌屬(Paraburkholderia)和Rokubacteriales；其中，芽胞桿菌屬 (Bacillus)、朱氏桿菌屬 (Chujaibacter)、土壤鏈霉菌屬 (Streptomyces)和伴伯克氏菌屬 (Paraburkholderia)健康植株的豐度比例高于香蕉枯萎病植株，芽胞桿菌屬 (Bacillus)和朱氏桿菌屬 (Chujaibacter)在香蕉植株根際土壤中屬于優(yōu)勢(shì)菌群。芽胞桿菌屬是厚壁菌門(mén)的一大類(lèi)細(xì)菌，在不利于生存的環(huán)境條件下具較強(qiáng)抗逆性[23]，屬于有益細(xì)菌。研究結(jié)果表明，優(yōu)勢(shì)菌屬芽胞桿菌屬 (Bacillus)在健康植株的根際土壤中豐度比例高于香蕉枯萎病植株，且差異顯著。這可能是芽胞桿菌屬對(duì)致病菌具有抵抗抑制作用，劉波[23]和杜貞娜[24]等研究也有相同結(jié)果。土壤鏈霉菌屬于放線(xiàn)菌門(mén)，是放線(xiàn)菌的次生代謝產(chǎn)物，對(duì)尖孢鐮刀菌等具有抑菌拮抗活性作用[25-26]，本研究土壤鏈霉菌在健康植株中的豐度比例高于枯萎病植株，在土壤中大量存在的土壤鏈霉菌可能抑制了枯萎病菌。研究結(jié)果還顯示，伴伯克氏菌屬 (Paraburkholderia)在健康植株中的豐度比例高于香蕉枯萎病植株?？赡苁怯捎诎椴耸暇鷮倌軌虼龠M(jìn)健康植株對(duì)磷素的吸收與利用[27-29]，繼而提高作物的抗逆性。

4 結(jié) 論

香蕉枯萎病和健康植株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在一定程度上具有同源性，但部分菌群在2種類(lèi)型植株根際土壤中的組成豐度有顯著差異。門(mén)水平上，厚壁菌門(mén) (Firmicutes)，棒狀桿菌門(mén) (Rokubacteria)，硝化螺旋菌門(mén) (Nitrospirae)，Latescibacteria和Dadabacteria等5個(gè)菌群差異顯著；屬水平上，芽胞桿菌屬 (Bacillus)，朱氏桿菌屬 (Chujaibacter)，土壤鏈霉菌屬 (Streptomyces)，伴伯克氏菌屬 (Paraburkholderia)和Rokubacteriales等5個(gè)屬差異顯著。