郭 輝，陳 燦，張宗瓊，夏秀忠，楊行海，張曉麗，徐志健，李丹婷，農(nóng)保選，馮 銳

(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/廣西水稻遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007)

【研究意義】亞洲稻癭蚊(Orseoliaoryzae)是南亞、東南亞和我國(guó)南方稻區(qū)的主要災(zāi)害性害蟲(chóng)之一，以山區(qū)稻區(qū)發(fā)生較重。該蟲(chóng)主要以幼蟲(chóng)蛀食水稻生長(zhǎng)點(diǎn)，使心葉停止生長(zhǎng)，基部膨大，形成“標(biāo)蔥”，危害嚴(yán)重時(shí)水稻不能抽穗結(jié)實(shí)。我國(guó)稻癭蚊年發(fā)生面積約98萬(wàn)hm2，損失稻谷約10億kg[1-2]。稻癭蚊為鉆蛀性害蟲(chóng)，化學(xué)防治效果不理想，而挖掘抗蟲(chóng)基因、培育推廣抗蟲(chóng)品種是防治稻癭蚊最經(jīng)濟(jì)安全的手段[3]。分子標(biāo)記輔助選擇(Molecular marker-assisted selection，MAS)是通過(guò)分析與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記來(lái)完成對(duì)目標(biāo)性狀的選擇，可有效縮短育種周期和提高育種效率，已在水稻、玉米和小麥等糧食作物及多種經(jīng)濟(jì)作物上廣泛應(yīng)用[4-6]。在傳統(tǒng)的稻癭蚊抗性育種中，抗性鑒定易受蟲(chóng)源、時(shí)間和環(huán)境的影響，耗時(shí)費(fèi)力。因此，通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇結(jié)合抗性鑒定，可縮短育種時(shí)間，減少抗蟲(chóng)鑒定工作量，提高育種效率，對(duì)水稻稻癭蚊抗蟲(chóng)育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自20世紀(jì)80年代以來(lái)，各國(guó)學(xué)者已報(bào)道了12個(gè)稻癭蚊抗性基因[7-8]，且除Gm9和Gm10基因外均已確定其在染色體上的位置。其中，Gm1基因是從材料W1263中鑒定到的顯性抗稻癭蚊基因，并定位到第9號(hào)染色體在標(biāo)記RM23941與RM23956之間[9-10]；Gm2、gm3、Gm6和Gm7基因成簇分布于第4號(hào)染色體長(zhǎng)臂31.02～31.84 Mb之間0.82 Mb范圍[10-14]，并已確定隱性基因gm3的候選基因?yàn)長(zhǎng)OC_Os04g52970[15]；Gm4和Gm8基因都定位到第8號(hào)染色體，其中Gm4基因在Abhaya中發(fā)現(xiàn)，位于標(biāo)記RM22551與RM22562之間0.33 Mb范圍，并確定LOC_Os08g09670為其候選基因[16-17]；材料Jhitpiti和Aganni都攜帶有Gm8基因，定位到標(biāo)記RM22685與RM22709之間430 kb范圍，并最終確定LOC_Os08g15080為其候選基因[18-19]；材料ARC5984攜帶有Gm5基因，最新定位到第12染色體在標(biāo)記Z57～Z64之間49 kb范圍，并篩選到2個(gè)候選基因LOC_Os12g36830和LOC_Os12g36880[20-21]。從CR57-MR1523中鑒定到Gm11(t)基因，同樣定位在第12號(hào)染色體，位于SSR標(biāo)記RM28574和RM28706之間，分別相距4.4和3.8 cM[22]。gm12基因是材料MN62M攜帶的抗稻癭蚊隱性基因，位于標(biāo)記RM6800與S2_411840之間100 kb范圍[8]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在已報(bào)道的抗稻癭蚊基因中，僅Gm6基因來(lái)源于我國(guó)，也是目前我國(guó)唯一在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用的抗稻癭蚊基因。為防范抗性基因單一水稻品種大面積種植后出現(xiàn)抗性喪失現(xiàn)象，有必要進(jìn)一步拓寬我國(guó)水稻抗稻癭蚊基因的材料來(lái)源?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究課題組前期從廣西稻種資源中篩選到1份全抗我國(guó)4種稻癭蚊生物型的材料GXM-002-1，經(jīng)遺傳分析與基因定位，將抗稻癭蚊基因定位到第12號(hào)染色體分子標(biāo)記12M-25與12M-29之間，與Gm5基因位置相同[20-21]，說(shuō)明與抗稻癭蚊基因Gm5是同一基因或等位基因。利用該抗源通過(guò)雜交和回交，結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇將其抗性基因轉(zhuǎn)入優(yōu)質(zhì)恢復(fù)系R553，選育出農(nóng)藝性狀優(yōu)良的抗稻癭蚊新品系，為培育抗稻癭蚊新品系提供良好種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料：供體親本為高抗稻癭蚊材料GXM-002-1，含有抗稻癭蚊基因Gm5，來(lái)自本課題組前期收集的廣西稻種資源；受體親本為水稻優(yōu)質(zhì)恢復(fù)系R553，為本單位優(yōu)質(zhì)雜交稻組選育提供?？刮脤?duì)照為多抗1號(hào)(含Gm6基因)，為廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育品種，感蚊對(duì)照為臺(tái)中1號(hào)(即TN1，不含抗蚊基因)，由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所稻種資源中心提供。

供試蟲(chóng)源：在廣西大新和馬山縣等地稻癭蚊發(fā)生危害時(shí)期，采集剛出現(xiàn)的乙型標(biāo)蔥，在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所溫室內(nèi)繁殖分型后以感蚊品種TN1飼養(yǎng)備用，生物型經(jīng)鑒別為中國(guó)Ⅳ型。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 選育流程 試驗(yàn)于2017—2020年在廣西南寧市進(jìn)行。以抗稻癭蚊材料GXM-002-1為父本，優(yōu)質(zhì)恢復(fù)系R553為輪回親本進(jìn)行雜交，并進(jìn)行2次回交后再自交；從BC1F1代開(kāi)始對(duì)后代進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，從分離群體中選出含有抗稻癭蚊基因且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的單株與輪回親本繼續(xù)回交，自交2次后選擇抗性基因純合且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的株系進(jìn)行抗稻癭蚊苗期鑒定(圖1)。

1.2.2 分子標(biāo)記 選用與基因Gm5連鎖及在抗源GXM-002-1與輪回親本R553間表現(xiàn)多態(tài)的分子標(biāo)記12M-29(F：5'- AGGTGTAGTTCTTGGCAAAT-3'，R：5'- TCTCTCTCGTGTTCTTGGAT -3')進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，在分離群體中選擇攜帶目標(biāo)基因的株系。引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.2.3 PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序 參照CTAB提取法從水稻葉片中提取DNA樣品，參考李孝瓊等[23]的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳和銀染檢測(cè)，略有改動(dòng)。PCR反應(yīng)體系10.0 μL：10×PCR Buffer(含Mg2+)1.0 μL，10 mmol/L dNTP 0.2 μL，5 U/μLTaqDNA聚合酶0.1 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.2 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O調(diào)至總體積10.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離和銀染，用保鮮膜包膠保存并記錄結(jié)果。

表1 水稻苗期稻癭蚊抗性鑒定評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.2.4 稻癭蚊抗性鑒定 參考國(guó)際稻癭蚊苗期群體鑒定法進(jìn)行稻癭蚊抗性鑒定[3]，將鑒別品種播于搪瓷育苗盆內(nèi)，每盆播12行，每行20～25苗，每個(gè)品種播2行，設(shè)4個(gè)重復(fù)。以多抗1號(hào)為抗蚊對(duì)照，TN1為感蚊對(duì)照。在秧苗2～3葉期，將育苗盆移至盛水的水泥池中，蓋上網(wǎng)罩，按每15～20苗接入經(jīng)交配的雌蚊1頭，在成蟲(chóng)產(chǎn)卵期和幼蟲(chóng)孵化期用濕布加蓋保濕。接蚊后18～25 d，即乙型標(biāo)蔥出現(xiàn)后，調(diào)查各鑒定材料的抗感株數(shù)，其中，稻株心葉抽不出、葉鞘畸形膨大呈“大肚秧”或葉鞘伸長(zhǎng)成管狀“標(biāo)蔥”為感蚊株，稻株心葉正常生長(zhǎng)為抗蚊株；統(tǒng)計(jì)各株系標(biāo)蔥率及抗性級(jí)別(表1)。以感蚊對(duì)照TN1標(biāo)蔥率在60%以上為試驗(yàn)有效標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 田間農(nóng)藝性狀調(diào)查 2020年7月中旬播種，8月上旬移栽，移栽后常規(guī)田間管理，于成熟期選取中間2行的3～5株，考察株高、有效穗、穗長(zhǎng)、每穗總粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重等主要農(nóng)藝性狀。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行整理，采用SPSS 19.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗稻癭蚊水稻改良株系的分子標(biāo)記輔助選擇和評(píng)價(jià)

2017年晚造，以R553與GXM-002-1進(jìn)行雜交；2018年早造，以R553為母本與F1回交，晚造用分子標(biāo)記從40株BC1F1中選擇2株含抗性基因的優(yōu)良單株與R553再回交；2019年早造，利用分子標(biāo)記從32株BC2F1中選擇2株含抗性基因的優(yōu)良單株進(jìn)行自交收種，晚造在苗期先用分子標(biāo)記從251株BC2F2中檢測(cè)到抗性基因純合單株58株(部分標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2)，全部移栽至大田，從中篩選得到農(nóng)藝性狀與R553相近的4個(gè)改良株系R553GM-15、R553GM-19、R553GM-31和R553GM-47。

2.2 水稻親本及改良株系苗期的稻癭蚊抗性表現(xiàn)

2020年早造收獲BC2F3世代種子，在8月對(duì)親本和4個(gè)株系的BC2F4世代進(jìn)行稻癭蚊苗期抗性鑒定(表2和圖3)。由表2可知，R533對(duì)稻癭蚊表現(xiàn)高感，GXM-002-1表現(xiàn)高抗，與抗蚊對(duì)照多抗1號(hào)相似；改良株系中的R553GM-15、R553GM-19和R553GM-31對(duì)稻癭蚊的抗性達(dá)中抗水平，R553GM-47達(dá)抗水平。說(shuō)明通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇，可獲得稻癭蚊抗性明顯提高的株系。

2.3 水稻親本及改良株系的主要農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果

2020年晚造，在正常田間水肥管理?xiàng)l件下，對(duì)親本和4個(gè)改良株系的農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果(表3)表明，R553GM-15和R553GM-31的株高與R553差異不顯著(P>0.05，下同)，R553GM-19和R553GM-47的株高極顯著高于R533(P<0.05，下同)；4個(gè)改良株系的有效穗數(shù)和千粒重與R553均無(wú)顯著差異；除R553GM-19的穗長(zhǎng)顯著短于R553外，其余3個(gè)改良株系的穗長(zhǎng)與R553均無(wú)顯著差異；R553GM-31的每穗總粒數(shù)與R553無(wú)顯著差異，其余3個(gè)改良株系的每穗總粒數(shù)均極顯著少于R553(P<0.01，下同)；R553GM-15的結(jié)實(shí)率與R553無(wú)顯著差異，其余3個(gè)改良株系的結(jié)實(shí)率均極顯著低于R533；4個(gè)改良株系的粒長(zhǎng)均短于R533，其中，R553GM-15的粒長(zhǎng)與R533差異不顯著，R553GM-19與R553GM-31的粒長(zhǎng)顯著短于R553，而R553GM-41的粒長(zhǎng)極顯著短于R553；4個(gè)改良株系的粒寬均大于R533，其中，R553GM-15和R553GM-19與R533差異不顯著，另2個(gè)改良株系的粒寬顯著大于R533。可見(jiàn)，導(dǎo)入抗稻癭蚊基因后改良株系各農(nóng)藝性狀中至少有1個(gè)株系與輪回親本無(wú)顯著差異，說(shuō)明采用分子標(biāo)記輔助將GXM-002-1的抗稻癭蚊基因Gm5導(dǎo)入優(yōu)質(zhì)恢復(fù)系R553具有可行性。

表2 苗期水稻的稻癭蚊抗性評(píng)價(jià)結(jié)果

3 討 論

分子標(biāo)記輔助選擇是一種高效的育種方法，可精確跟蹤目標(biāo)基因進(jìn)行選擇，已成功培育了大批優(yōu)良品系。王春連等[24]篩選到與抗白葉枯基因Xa23緊密連鎖的EST標(biāo)記C189，其標(biāo)記輔助選擇的正確率接近100.0%。李進(jìn)波等[25-26]利用EST標(biāo)記C189進(jìn)行輔助選擇，也獲得3份優(yōu)良抗性雜交稻恢復(fù)系；通過(guò)與Bph14和Bph15基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記MRG2329和MS5的輔助選擇，獲得多份抗褐飛虱株系，并獲得6份聚合雙基因的高抗株系。Qing等[27]采用分子標(biāo)記輔助選擇將抗褐飛虱基因Bph3導(dǎo)入桂恢582和桂7571，使其抗性明顯增強(qiáng)。劉馳等[28]通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇培育出聚合了抗稻瘟病基因Pi-ta、Pib、Pi54和抗白葉枯病兼抗細(xì)條病基因xa5的多抗優(yōu)質(zhì)強(qiáng)恢復(fù)系桂恢663。在抗稻癭蚊方面，黃顯波等[29-30]、李云等[31]利用與Gm6基因連鎖的分子標(biāo)記檢測(cè)明恢884、雙抗明占、抗15-1、抗8和淦恢3等多個(gè)恢復(fù)系，確定其含有抗稻癭蚊Gm6基因。林成豹等[32]采用連續(xù)回交結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇方法將Gm6基因?qū)朐SB，再與元豐A多代回轉(zhuǎn)育成抗稻癭蚊三系不育系BSC9247。Kumar等[33]利用分子標(biāo)記輔助選擇將Xa21與Gm4和Gm8基因分別聚合到恢復(fù)系RPHR-1005中，提高了RPHR-1005對(duì)白葉枯與稻癭蚊的抗性。Zhou等[21]篩選出幾個(gè)與Gm5基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，可用于不同材料間的分子標(biāo)記輔助選擇。本研究利用與抗稻癭蚊基因Gm5緊密連鎖的在R553與GXM-002-1間有多態(tài)性的標(biāo)記M12-29，采用雜交、回交方法，在分離群體中利用標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，結(jié)合抗性鑒定與農(nóng)藝性狀選擇，獲得了對(duì)稻癭蚊抗性提高的優(yōu)良株系，與上述研究結(jié)果一致，可為水稻抗稻癭蚊育種提供重要的遺傳基因材料。

表3 水稻親本及抗稻癭蚊改良株系的農(nóng)藝性狀比較

農(nóng)藝性狀一直是水稻育種中優(yōu)先考慮的重要因素，在分子標(biāo)記輔助選擇中，不僅要跟蹤目標(biāo)基因，更要保持好親本的優(yōu)良農(nóng)藝性狀。周元飛等[34]運(yùn)用分子標(biāo)記輔助選擇將抗白葉枯基因Xa21轉(zhuǎn)入輪回親本9311，獲得4個(gè)優(yōu)良抗性株系，除株高和葉色與輪回親本略有不同外，其他性狀差異不明顯，且與培矮64S配組的F1與兩優(yōu)培九各項(xiàng)指標(biāo)非常相似。潘曉飚等[35]以明恢86、蜀恢527和浙恢7954為受體，以三黃占2號(hào)和IRBB23為供體，通過(guò)標(biāo)記輔助聚合4個(gè)抗稻瘟病位點(diǎn)和Xa23基因，獲得5個(gè)抗性改良恢復(fù)系，與原恢復(fù)系相比，單株產(chǎn)量無(wú)顯著差異，穗長(zhǎng)縮短，每穗粒數(shù)減少，千粒重下降，株高降低，但結(jié)實(shí)率有提高趨勢(shì)；在與II-32A的測(cè)交種中，除明浙-G1-G2-G8-Xa23/II-32A的單株產(chǎn)量顯著提高外，其余改良恢復(fù)系/II-32A的單株產(chǎn)量與原恢復(fù)系/II-32A的單株產(chǎn)量相仿。王飛名等[36]利用標(biāo)記輔助改良黃華占，獲得3個(gè)抗旱且攜帶Bph15基因的純合株系，這3個(gè)株系的產(chǎn)量、每穗總粒數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)、有效穗數(shù)和結(jié)實(shí)率等與黃華占均無(wú)顯著差異，株高極顯著增高，其中有2個(gè)株系的穗長(zhǎng)和千粒重存在顯著差異；3個(gè)株系的株高與輪回親本均存在極顯著差異。本研究中，4個(gè)改良株系中有2個(gè)株系的株高與輪回親本相近，另2個(gè)株系的株高顯著高于輪回親本，理論單株產(chǎn)量、有效穗數(shù)和千粒重與輪回親本無(wú)顯著差異，與上述研究結(jié)果相似。此外，本研究中4個(gè)改良株系的其他農(nóng)藝性狀如每穗總粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、穗長(zhǎng)、粒長(zhǎng)和粒寬等性狀中，至少有1個(gè)株系與輪回親本無(wú)顯著差異，表明在抗性改良中，仍會(huì)產(chǎn)生較大的遺傳累贅效應(yīng)，需通過(guò)多代回交或擴(kuò)大選擇群體來(lái)獲得抗性與優(yōu)良農(nóng)藝性狀俱佳的株系。

4 結(jié) 論

以高抗稻癭蚊材料GXM-002-1為抗源供體親本，以?xún)?yōu)質(zhì)水稻恢復(fù)系R553為輪回親本，通過(guò)回交育種結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇與抗蟲(chóng)鑒定，可獲得稻癭蚊抗性達(dá)抗或中抗、農(nóng)藝性狀表現(xiàn)良好的改良株系。