陸鋒藝 王雨 莊汝杰*

骨性關(guān)節(jié)炎（Ostereoarthritis，OA）是最常見的關(guān)節(jié)退行性疾病，臨床上以嚴(yán)重的疼痛及肢體功能活動障礙為主要特點(diǎn)［1］，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。然而，OA的發(fā)病機(jī)制尚不明確，既往臨床多責(zé)之于關(guān)節(jié)軟骨，關(guān)于關(guān)節(jié)軟骨的信號機(jī)制研究包括C5、hypoxia-inducible factor-2ɑ、syndecan-4、ADAMTS 等［2-5］。本研究通過建立小鼠膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型，并用氯膦酸二鈉脂質(zhì)體（Clodronate liposomes，CL）進(jìn)行干預(yù)，觀察膝關(guān)節(jié)破壞情況，以探討氯膦酸二鈉脂質(zhì)體對膝骨關(guān)節(jié)炎的影響。巨噬細(xì)胞可吞噬注入人體內(nèi)的氯膦酸二鈉脂質(zhì)體，消化脂質(zhì)體釋放氯膦酸二鈉，在巨噬細(xì)胞內(nèi)聚集達(dá)到一定濃度后，巨噬細(xì)胞失去活性并凋亡［6］。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、試劑與耗材 8 周齡雄性C57BL/6 小鼠，購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。氯膦酸二鈉脂質(zhì)體（LIPOSOMA，CP-005-005），帕瑞西布鈉（MCE，HY-17474A），Collagen 2 抗體（Abcom，Ab34712），MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒（Beyotime，C0009S），RAW264.7 小鼠單核巨噬細(xì)胞系（Procell，CL-0190），96 孔板孔細(xì)胞培養(yǎng)板（NEST），DMEM 培養(yǎng)基（gibco），特級胎牛血清（HYCLONE，SH30070.03）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 SPF 級健康8 周齡雄性C57BL/6 小鼠30 只，隨機(jī)均分為A（CL）組，B（帕瑞西布鈉）組，C（空白對照）組，每組各10 只。A 組和B 組小鼠進(jìn)行DMM 造模，建立小鼠KOA 模型，C 組不做處理。造模步驟參考WELCH 等［7］，術(shù)后4 周關(guān)節(jié)炎造模成功。在造模成功前1 周，A 組小鼠膝關(guān)節(jié)注射氯膦酸二鈉脂質(zhì)體（1 mg/mL）6μL，1 次，進(jìn)行巨噬細(xì)胞耗竭。從術(shù)后第4 周開始，B 組小鼠關(guān)節(jié)腔注射帕瑞昔布鈉（1 mg/mL）20μL，1 周2 次。C 組小鼠注射生理鹽水20μL，1 周2 次。

1.3 檢測指標(biāo) 于造模后第4 周、第8 周獲取小鼠膝關(guān)節(jié)標(biāo)本，并采用4%多聚甲醛固定。置于10%甲醛溶液中固定48 h 后，經(jīng)0.27 mol/mL EDTA-2Na 脫鈣2 個月，每隔1 周更換脫鈣液。脫鈣后將膝關(guān)節(jié)石蠟包埋，從關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)邊緣開始于矢狀平面連續(xù)切片，進(jìn)行常規(guī)HE 染色及Ⅱ型膠原免疫組化，比較各組膝關(guān)節(jié)軟骨的病理變化。染色結(jié)果半定量分析以染色強(qiáng)度結(jié)合陽性細(xì)胞數(shù)百分比綜合計(jì)分。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將RAW264.7 巨噬細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105個/mL，接種于96 孔板，100 μL/孔，置37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)貼壁培養(yǎng)3 h，分為空白對照組（0μg/mL）、空白脂質(zhì)體組（150 μg/mL、175 μg/mL、200 μg/mL、225 μg/mL、250 μg/mL、275 μg/mL、300 μg/mL），CL 組（150 μg/mL、175 μg/mL、200 μg/mL、225 μg/mL、250 μg/mL、275 μg/mL、300 μg/mL），各組3 個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24 h 后，加入10 μL 配置好的MTT 溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。每孔加入100μL Formazan 溶解液，適當(dāng)混勻，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)再繼續(xù)孵育。直至在普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Formazan 全部溶解，在570 nm 測定吸光度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，采用重復(fù)測量方差分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠膝關(guān)節(jié)HE 染色及二型膠原免疫組化 空白對照組為正常關(guān)節(jié)軟骨，CL 組的關(guān)節(jié)表面破壞較少，保留較多的健康完整的軟骨細(xì)胞。4周時帕瑞昔布組還有保留較多的軟骨細(xì)胞，8 周時軟骨細(xì)胞退變嚴(yán)重，關(guān)節(jié)表面破壞較CL 組嚴(yán)重。說明CL 可延緩軟骨細(xì)胞的退變。見圖1。

圖1 各組小鼠膝關(guān)節(jié)HE染色及二型膠原免疫組化（×40）

2.2 不同濃度CL 培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的變化 巨噬細(xì)胞吞噬CL 后，氯膦酸二鈉在細(xì)胞內(nèi)聚集，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞凋亡，最終留下富含脂質(zhì)體的巨噬細(xì)胞，稱為泡沫細(xì)胞，見圖2。MTT 試驗(yàn)后，獲得不同組的OD 值，空白脂質(zhì)體組各濃度之間無差異（P＞0.05）；CL 組各濃度之間，150 μg/mL、175 μg/mL、200 μg/mL、225 μg/mL、250 μg/mL 之間的OD 值存在差異（P＜0.05），而275 μg/mL、300 μg/mL 較高濃度下的OD 值無明顯差異（P＞0.05），巨噬細(xì)胞幾乎均轉(zhuǎn)化為充滿脂質(zhì)的泡沫細(xì)胞。150 μg/mL、175 μg/mL 較低濃度下的OD 值反而高于空白對照組（0μg/mL），可見低濃度CL 對巨噬細(xì)胞的增殖有一定的促進(jìn)作用。見表1 和圖3。

圖2 不同濃度CL培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞

表1 不同CL濃度培養(yǎng)下MTT試驗(yàn)后的OD值比較（±s）

表1 不同CL濃度培養(yǎng)下MTT試驗(yàn)后的OD值比較（±s）

濃度（μg/mL）0150175200225250275300空白脂質(zhì)體0.445±0.0490.435±0.0820.507±0.0950.436±0.0430.400±0.0480.412±0.0880.338±0.1230.330±0.125氯膦酸二鈉脂質(zhì)體0.418±0.0690.605±0.1320.529±0.1150.424±0.0220.354±0.0750.264±0.0570.279±0.0440.275±0.068

圖3 不同CL濃度培養(yǎng)下MTT試驗(yàn)后的OD值柱狀圖

3 討論

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（Knee Ostereoarthritis，KOA）是一種退行性骨關(guān)節(jié)疾病，是由衰老、肥胖和遺傳等多種原因引起的滑膜炎癥、關(guān)節(jié)軟骨的損傷、骨贅生成、韌帶松弛和關(guān)節(jié)周圍肌肉減弱。早預(yù)防、早診斷并給予有效的治療，不僅可以緩解疼痛癥狀、改善其生活質(zhì)量，還可以降低晚期膝關(guān)節(jié)置換率，減輕家庭和社會的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。研究發(fā)現(xiàn)，骨關(guān)節(jié)炎小鼠的滑膜組織中炎性巨噬細(xì)胞增加［8］，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等炎性細(xì)胞因子，會加劇疼痛癥狀［9］，促進(jìn)疾病發(fā)展［10］。比如，IL-6 等細(xì)胞因子為主的炎癥反應(yīng)可以抑制軟骨中的聚糖蛋白和膠原合成，并上調(diào)MMP-13［11］；組織金屬蛋白酶抑制劑的下調(diào)也可導(dǎo)致MMPs 上調(diào)。因?yàn)檐浌羌?xì)胞外基質(zhì)中90%～95%的成分為Ⅱ型膠原蛋白，而MMPs 中的MMP-13 對裂解Ⅱ型膠原蛋白的活性最強(qiáng)［12］。

氯膦酸二鈉脂質(zhì)體是一種人工合成的雙膦酸脂，是一種破骨細(xì)胞抑制劑，臨床多用于骨質(zhì)疏松的治療［13］。巨噬細(xì)胞可吞噬注入人體內(nèi)的CL，消化脂質(zhì)體釋放氯膦酸二鈉，在巨噬細(xì)胞內(nèi)聚集達(dá)到一定濃度后，巨噬細(xì)胞失去活性并凋亡，而體內(nèi)的其它細(xì)胞如平滑肌細(xì)胞，由于不能吞噬體循環(huán)中游離的氯膦酸二鈉，而且氯膦酸二鈉的半衰期較短，對體內(nèi)除吞噬細(xì)胞以外的其他細(xì)胞無明顯影響。VAN LENT 等［14］研究證實(shí)，在RA中CL 消耗巨噬細(xì)胞后，膝關(guān)節(jié)的炎癥表達(dá)明顯減少，但仍有相當(dāng)多的蛋白多糖丟失，輕微的炎癥仍然可以對軟骨造成破壞。BLOM 等［15］在膠原酶誘導(dǎo)小鼠膝關(guān)節(jié)實(shí)驗(yàn)性骨性關(guān)節(jié)炎中，于關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射CL 后，滑膜巨噬細(xì)胞耗盡導(dǎo)致骨贅形成顯著減少，說明滑膜巨噬細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)性O(shè)A 過程中是滑膜介導(dǎo)骨贅形成和其他OA 相關(guān)病理（如纖維化）的關(guān)鍵細(xì)胞，而CL 可以通過消耗滑膜巨噬細(xì)胞以減輕炎癥反應(yīng)。TAKANO 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，滑膜巨噬細(xì)胞是OA 小鼠降鈣素受體樣受體（CLR）的主要IL-1β 產(chǎn)生和調(diào)節(jié)細(xì)胞，可以用CL 小鼠的巨噬細(xì)胞耗竭降低滑膜中IL-1β 和CLR 基因的表達(dá)。李洪強(qiáng)等［17］研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在KOA 的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，可以影響軟骨細(xì)胞增殖、凋亡和代謝，刺激釋放基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）及其他代謝介質(zhì)來降解軟骨基質(zhì)。IL-33 和ST2在人和鼠骨關(guān)節(jié)炎中升高［18］，IL-33 水平的升高加劇鼠骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展，進(jìn)而增加軟骨降解蛋白酶（MMP-13、MMP-3 和ADAMTS-5）的表達(dá)，減少軟骨形成標(biāo)志物（COL2A1、SOX-9 和Aggrecan）。而OA 關(guān)節(jié)中的IL-33主要來自軟骨細(xì)胞，所以在體內(nèi)中和IL-33 和ST2 可以減少軟骨退化和疼痛。

關(guān)于CL 消耗巨噬細(xì)胞減輕炎癥反應(yīng)的研究，既往實(shí)驗(yàn)雖然證實(shí)了CL 在OA 中可見較少骨贅的生成，減少IL-1β 等炎癥基因表達(dá)，但CL 在OA 中的研究仍較少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了CL 對軟骨的保護(hù)作用以及對巨噬細(xì)胞的耗竭作用。后續(xù)研究將繼續(xù)驗(yàn)證CL 耗竭巨噬細(xì)胞后，膝關(guān)節(jié)中IL-6、MMP-13、TIMP-1、VEGF 以及IL-33 的表達(dá)。從目前證據(jù)來看，氯膦酸二鈉脂質(zhì)體具有緩解OA 癥狀、保護(hù)軟骨的潛力，但具體通過調(diào)節(jié)哪些細(xì)胞因子來緩解OA，有待進(jìn)一步研究探討。