徐彬 丁偉國 盛紅楓 徐衛(wèi)星*

腰腿疼痛是成年人最常見的不適癥狀［1］，而椎間盤退變（intervertebral disc degeneration，IDD）是導(dǎo)致腰腿疼痛的最常見原因之一［2］。年齡、基因、營養(yǎng)、代謝、感染、生物力學(xué)等諸多因素都與IDD 發(fā)病相關(guān)，但確切的發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前，主要的治療手段有保守治療、介入治療、手術(shù)治療，既不能延緩椎間盤的退變進(jìn)程，也不能對退變椎間盤進(jìn)行再生修復(fù)。IDD 可歸屬中醫(yī)“腰腿痛”范疇，認(rèn)為其由肝腎虧虛、血瘀氣弱引起［3］，治以補(bǔ)肝益腎、活血通經(jīng)為主，當(dāng)歸、白芍是常用藥物，此藥對源自《仙授理傷續(xù)斷秘方》治療外傷瘀血作痛之主方四物湯，也常常出現(xiàn)在獨(dú)活寄生湯等治療骨傷疾病的經(jīng)方中。研究表明，中藥治療腰椎間盤退變是通過多種功效的不同活性成分作用于多個環(huán)節(jié)或信號通路及靶點(diǎn)而產(chǎn)生治療效果。當(dāng)歸-白芍藥對治療腰椎間盤退變?nèi)蕴幱诔跫夒A段，作用機(jī)制中涉及的活性成分、治療靶點(diǎn)及信號通路仍不完全清楚。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論系統(tǒng)、科學(xué)的探究當(dāng)歸-白芍藥對治療腰椎間盤退變的作用靶點(diǎn)及機(jī)制。

1 研究方法

1.1 當(dāng)歸-白芍的活性成分及作用靶點(diǎn)篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）數(shù)據(jù)庫中分別以“當(dāng)歸”“白芍”為檢索詞，檢索其活性成分，設(shè)定口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 進(jìn)行篩選。使用Pubchem數(shù)據(jù)庫獲得上述成分的SDF 結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫，取預(yù)測得分大于0 的靶標(biāo)作為藥物靶點(diǎn)。

1.2 疾病相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 使用OMIM、Disgenet、Genecards 數(shù) 據(jù) 庫 以“intervertebral disc degeneration”“l(fā)umbar intervertebral disc degeneration”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲得疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 當(dāng)歸-白芍治療治療腰椎間盤退變關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 在Venny2.1 在線軟件作圖工具平臺上輸入篩選出的當(dāng)歸-白芍藥對作用靶點(diǎn)及腰椎間盤退變關(guān)鍵靶點(diǎn)，繪制韋恩圖，兩者取交集后獲得藥物-疾病共同靶點(diǎn)。1.4 中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)和藥物活性成分信息編輯成“藥物-成分”“成分-靶點(diǎn)”“疾病-靶點(diǎn)”關(guān)系文件和屬性文件，使用Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病” 網(wǎng)絡(luò)圖。節(jié)點(diǎn)為當(dāng)歸、白芍、藥物活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)及腰椎間盤退變，邊為當(dāng)歸、白芍與對應(yīng)活性成分、活性成分與靶點(diǎn)、腰椎間盤退變與靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系。

1.5 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)分析 將上述藥物-疾病共同靶點(diǎn)輸入至STRING 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為0.4，構(gòu)建蛋白相互作用的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 核心靶點(diǎn)篩選 將PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscap 3.7.2中，通過Network Analyzer 工具進(jìn)行拓?fù)浞治?，以degree，betweenness centrality，average shortest path length 和closeness centrality 四個參數(shù)為參考標(biāo)準(zhǔn)，通過degree 排序，選取分值大于平均分的基因作為核心靶點(diǎn)，將前30 個靶點(diǎn)使用R 3.6.1 繪制條形圖。使用MCODE 模塊進(jìn)行基因簇的分析以及核心靶點(diǎn)的篩選。

1.7 核心靶點(diǎn)基因功能和通路富集分析 基于R 軟件使用Bioconductor 生物信息軟件包以P value＜0.05，Q value＜0.05 進(jìn)行關(guān)鍵靶基因GO 功能富集分析與KEGG通路富集分析，并將結(jié)果以條形圖和氣泡圖形式輸出。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸-白芍的活性成分及作用靶點(diǎn)篩選 在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中設(shè)定OB ≥30%、DL ≥0.18，對當(dāng)歸、白芍的有效成分進(jìn)行篩選。共得到潛在活性成分14 個，其中當(dāng)歸2 個，白芍13 個，包括豆甾醇、谷甾醇、β-谷甾醇、丁子香萜、山奈酚、（+）-兒茶素、芍藥苷元、芍藥新苷、芍藥苷、芍藥苷_qt、芍藥內(nèi)酯苷_qt、苯甲酰芍藥苷，活性成分β-谷甾醇為兩者共有，見表1。使用Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫篩選出342 個藥物靶點(diǎn)，其中當(dāng)歸43 個，白芍342 個。

表1 當(dāng)歸-白芍的活性成分

2.2 當(dāng)歸-白芍治療治療腰椎間盤退變的關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 在OMIM、Disgenet、Genecards 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，去重后共獲得腰椎間盤退變靶點(diǎn)1110 個。在Venny2.1在線軟件作圖工具平臺上輸入342 個藥物靶點(diǎn)、1110個疾病靶點(diǎn)，繪制韋恩圖，兩者取交集后獲得藥物-疾病共同靶點(diǎn)69 個。見圖1。

圖1 當(dāng)歸-白芍治療腰椎間盤退變的關(guān)鍵靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將白芍-當(dāng)歸中14 個潛在活性成分與69 個藥物-疾病共同靶點(diǎn)輸入Cytoscape 軟件中，刪除與靶點(diǎn)無交集的孤立成分，繪制出“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2），發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸-白芍有13 種活性成分，1 個活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)無交集，予刪除，為（+）-兒茶素。

圖2 當(dāng)歸-白芍治療腰椎間盤退變的藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)分析 構(gòu)建蛋白相互作用的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，包括69 個節(jié)點(diǎn)，643 條邊，見圖3。通過degree 排序，將前30 個靶點(diǎn)使用R 3.6.1 繪制條形圖（見圖4），前10 名包括AKT1、EGFR、VEGFA、CASP3、CXCL8、MAPK8、CCND1、JUN、FGF2、MAPK14。使用MCODE 模塊進(jìn)行基因簇的分析以及核心靶點(diǎn)的篩選。總共得到3 個基因簇和2 個核心基因，核心基因為JUN、CCR1。

圖3 當(dāng)歸-白芍治療腰椎間盤退變蛋白相互作用PPI圖

圖4 當(dāng)歸-白芍治療腰椎間盤退變的核心靶點(diǎn)

2.5 核心靶點(diǎn)基因功能和通路富集分析 將69個共同靶點(diǎn)經(jīng)R 語言運(yùn)行后GO 分析分子功能。GO 功能富集分析共確定79 個與分子生物功能相關(guān)的條目，主要有內(nèi)肽酶活力、金屬內(nèi)肽酶活性、1-磷脂酰肌醇-3-激酶活性、磷脂酰肌醇3-激酶活性、磷脂酰肌醇磷酸激酶活性、金屬肽酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、生長因子結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、類固醇激素受體活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、絲氨酸肽酶活性、磷酸酶結(jié)合、絲氨酸水解酶活性、胰島素受體底物結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、參與凋亡過程的半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性、核受體活性，見圖5。將69 個共同靶點(diǎn)經(jīng)R 語言運(yùn)行后共得到134 條KEGG 通路，前20 的結(jié)果形成KEGG 功能富集的條形圖（見圖6），包括TNF 信號通路、IL-17 信號通路、HIF-1 信號通路、雌激素信號通路、細(xì)胞凋亡。

圖5 當(dāng)歸-白芍治療腰椎間盤退變的GO功能富集分析結(jié)果

圖6 當(dāng)歸-白芍治療腰椎間盤退變的KEGG富集分析

3 討論

臨床上，眾多補(bǔ)益肝腎、活血通經(jīng)的中藥被用于治療腰椎間盤退變導(dǎo)致的腰腿痛。通過數(shù)據(jù)挖掘分析中醫(yī)醫(yī)案古籍腰痛癥用藥規(guī)律，發(fā)現(xiàn)高頻用藥中包括當(dāng)歸和白芍［4］。林浩等［5］采用含有當(dāng)歸和白芍的當(dāng)歸四逆湯治療腰椎間盤突出癥，發(fā)現(xiàn)其可降低組胺、5-羥色胺、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素1β 水平，緩解腰部疼痛、改善腰椎功能。王浩平等［6］治療腰椎間盤突出，在實施椎間孔鏡的基礎(chǔ)上應(yīng)用含有當(dāng)歸與白芍的獨(dú)活寄生湯，發(fā)現(xiàn)獨(dú)活寄生湯可以進(jìn)一步緩解疼痛，提高療效。王曉東［7］采用獨(dú)活寄生湯治療椎間盤源性腰痛亦取得良好療效。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析當(dāng)歸-白芍此藥對治療腰椎間盤退變的分子生物學(xué)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)在當(dāng)歸-白芍此藥對中起治療作用的活性成分包括β-谷甾醇、山奈酚、芍藥苷、豆甾醇、谷甾醇等。芍藥苷，可以抑制FasL 表達(dá)，進(jìn)而抑制IL-6 及TNF-α 等炎性因子的分泌，最終起到抑制髓核細(xì)胞凋亡的作用［8］；對椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞具有明顯的促增殖作用，F(xiàn)as 配體誘導(dǎo)椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞有保護(hù)作用［9］；可有效抑制纖維環(huán)細(xì)胞炎癥模型IL-1β、IL-6 和TNF-a 的表達(dá)［10］。β-谷甾醇，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗衰老、保護(hù)肝腎功能以及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、骨代謝的作用［11］。山奈酚，可以降低IL-1β、IL-18、Caspase-1、Caspase-3、Caspase-9、NLRP3 等炎癥因子及促炎因子的表達(dá)，具有抗炎、抗氧化、抗菌等藥理作用，同時可以抑制大鼠蛋白尿、血肌酐和尿素氮含量，起到保護(hù)腎臟組織及功能的作用［12］。ZHU 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，山奈酚可通過抵消脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并增加細(xì)胞增殖來增強(qiáng)細(xì)胞活力；還可提高SOX-9、膠原II 和蛋白聚糖等軟骨生成標(biāo)志物的水平，降低基質(zhì)降解酶的水平，提示其具有成骨作用；可通過降低促炎細(xì)胞因子的水平和通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子的核易位而增加抗炎細(xì)胞因子來減輕炎癥。因此，筆者推測當(dāng)歸-白芍藥對可能是通過抑制炎癥、抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)骨代謝、保護(hù)肝腎等作用治療腰椎間盤退變。

當(dāng)歸-白芍藥對與腰椎間盤退變，藥物-疾病共同靶點(diǎn)有69 個，包括AKT1、EGFR、VEGFA、CASP3、CXCL8、MAPK8、CCND1、JUN、FGF2、MAPK14 等。69 個共同靶點(diǎn)經(jīng)過GO 功能富集分析后，發(fā)現(xiàn)與之相關(guān)的的分子生物功能包括內(nèi)肽酶活力、金屬內(nèi)肽酶活性、1-磷脂酰肌醇-3-激酶活性、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）活性、磷脂酰肌醇磷酸激酶活性等。PI3K 參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，VEGFA、FGF 等多種生長因子都能啟動PI3K 的激活。AKT 是PI3K 下游主要的效應(yīng)物，亦稱蛋白激酶B（PKB），可通過磷酸化多種酶、激酶和轉(zhuǎn)錄因子等下游因子，參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)［14］。研究表明，PI3K/AKT 信號通路的激活可增加細(xì)胞外基質(zhì)的含量，預(yù)防細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬，減輕氧化損傷以及適應(yīng)低氧微環(huán)境，起到保護(hù)椎間盤的作用［15］。HUANG等［16］發(fā)現(xiàn)，椎間盤退變患者的髓核細(xì)胞中EGFR 表達(dá)更高，且與退變的程度成正比，此外EGFR 激活的Akt/GSK3 信號通路可促進(jìn)CXCL8 的表達(dá)。CXCL8 在退變椎間盤髓核細(xì)胞中表達(dá)增高，并在腰椎間盤退變的進(jìn)程中扮演了重要作用［17］，還與腰椎間盤突出引起的神經(jīng)根性疼痛有關(guān)［18］。CASP3 是細(xì)胞凋亡途徑中最為關(guān)鍵的酶之一，與椎間盤退變的發(fā)表的機(jī)制有著密切的聯(lián)系［19］。PI3K/Akt/mTOR/caspase-3 信號通路與PI3K/Akt/GSK3β/caspase-3 信號通路均參與了利拉魯肽抵抗激素導(dǎo)致髓核細(xì)胞凋亡，起到保護(hù)椎間盤的作用［20］。HIF-1 是缺氧反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，分為HIF-1α 和HIF-1β［21］，其中HIF-1α 通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、線粒體凋亡等途徑參與椎間盤退變的發(fā)生［22］。此外，筆者發(fā)現(xiàn)TNF 信號通路、IL-17 信號通路、雌激素信號通路等也可能參與當(dāng)歸-白芍藥對治療腰椎間盤退變的作用機(jī)制，而這些信號通路與抑制炎癥、抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫密切相關(guān)。

綜上所述，當(dāng)歸-白芍對腰椎間盤退變可能起到治療效果的活性成分包括包括β-谷甾醇、山奈酚、芍藥苷等，可能通過AKT1、EGFR、VEGFA、CASP3、CXCL8 等靶點(diǎn)及TNF、IL-17、HIF-1 等信號通路發(fā)揮治療作用，為進(jìn)一步研究當(dāng)歸-白芍治療腰椎間盤退變的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。