李剛 韓楠楠 張可 李恒杰

急性一氧化碳中毒（acute carbon monoxide poisoning，ACOP）是我國(guó)常見(jiàn)的毒性氣體損傷[1]。一氧化碳（carbon monoxide，CO）可與血液中的血紅蛋白相結(jié)合形成碳氧血紅蛋白（carboxyhemoglobin，COHb），降低血紅蛋白的攜氧能力，造成相關(guān)器官損傷，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。ACOP 易損傷心臟，可導(dǎo)致心肌損傷、心律失常、心功能不全及急性心肌梗死[2-3]。本團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果顯示，紅景天苷對(duì)ACOP 導(dǎo)致的心肌損傷有保護(hù)作用[4]，但未明確紅景天苷對(duì)ACOP 心肌損傷治療作用的具體機(jī)制。缺氧誘導(dǎo)因子的活性亞基為缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factot-1α,HIF-1α），此外磷脂酰肌醇-3-激酶/ 蛋白激酶B（phosphatidylinosition-3-kinase/Akt，PI3K/Akt） 信號(hào)通路在心臟功能調(diào)節(jié)和代謝過(guò)程中扮演著重要角色，可調(diào)節(jié)心肌肥厚、心肌纖維化和心肌重塑，其表達(dá)與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。有研究表明紅景天苷可通過(guò)PI3K/Akt 促進(jìn)HIF-1α 蛋白穩(wěn)定表達(dá)[5]。本研究旨在探討PI3K/Akt通路在紅景天苷對(duì)ACOP 心肌損傷治療過(guò)程中的作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 選擇SPF 級(jí)成年SD 大鼠48 只（由上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供），雌雄各半，平均體重（280±20）g，飼養(yǎng)于20～25 ℃、相對(duì)濕度范圍40%～70%的動(dòng)物房中2 周。本研究經(jīng)杭州赫貝科技有限公司動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：HB20200 119090021LG-B）。

1.2 主要試劑與儀器 99.99%高純度CO 氣體由瀘州西南化工研究所制備（批號(hào)：781941）；紅景天苷由成都德瑞可生物科技有限公司提供（批號(hào)：DRK-1900-943617，規(guī)格：5 mg/ 支），0.9%氯化鈉注射液由浙江大冢制藥有限公司提供（批號(hào)：20200416，規(guī)格10 ml/ 支）。PI3K/Akt 拮抗劑由美國(guó)MedChem Express 有限公司提供（批號(hào)：52336）；PI3K/Akt 激動(dòng)劑由美國(guó)Santa Cruz 公司提供（批號(hào)：11928）；白細(xì)胞介素6 （interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、HIF-1α ELISA 試劑盒均由上海江萊生物提供（批號(hào)分別為：20268、10484、18090，113276）；紅細(xì)胞裂解液由杭州聯(lián)科生物提供（批號(hào)：MR0504-500；CD284）；PI3K/Akt/HIF-1α 抗體由美國(guó)eBioscience 提供（批號(hào)：12-9041-80）。

1.3 方法

1.3.1 模型制備 采用改良式腹腔注射CO 法制備大鼠重度CO 中毒模型[6]，即首次100 mL/kg CO 腹腔注射，每間隔4 h 追加1 次，追加劑量為首次劑量的一半（即50 mL/kg），共追加3 次，然后測(cè)定COHb，＞50%即為模型制備成功。

1.3.2 用藥方法 模型制備成功后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為4組，每組12 只，分別為單純紅景天苷組（紅景天苷組）、紅景天苷加PI3K/Akt 拮抗劑組（合并拮抗劑組）、紅景天苷加PI3K/Akt 激動(dòng)劑組（合并激動(dòng)劑組）及對(duì)照組。4組大鼠均采用尾靜脈注射方法予以紅景天苷（10 mg/kg）、紅景天苷（10 mg/kg）加PI3K/Akt 拮抗劑（0.5 mg/kg）、紅景天苷（10 mg/kg）加PI3K/Akt 激動(dòng)劑（0.5 mg/kg）、0.9%氯化鈉注射液（5 mL/kg）注射。

1.3.3 大鼠COHb、存活率及心肌損傷標(biāo)志物測(cè)定模型制備后立即眶下靜脈叢采血1 mL，采用全自動(dòng)血?dú)夥治鰞x測(cè)定COHb。記錄4組大鼠用藥后24 h存活率。用藥后24 h 眶下靜脈叢采血1 mL，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)4組天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）、肌酸激酶（creatine kinase,CK）、肌酸激酶MB 同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）水平。

1.3.4 心肌組織HE 染色 兩次采血后，予腹腔注射5%水合氯醛6 mL/kg 麻醉，立即打開(kāi)胸腔，無(wú)菌條件下分離并取出心臟，取一半置于-80 ℃液氮保存、備用，余下部分于4%甲醛溶液中固定3 d，切成2 mm×2 mm×2 mm 左右的立方體小塊，流水沖洗組織中的甲醛。分別置于80%、90%、95%、100%的乙醇中浸泡40 min 脫水，二甲苯浸泡30 min，浸于液體石蠟4 h。使用石蠟包埋機(jī)對(duì)組織塊進(jìn)行包埋，包埋后使用切片機(jī)切成4 μm 的石蠟薄片，放入65 ℃恒溫箱中12 h。脫蠟后依次用蘇木素、酸性乙醇、氨水、伊紅進(jìn)行染色，最后用樹(shù)膠封片風(fēng)干，顯微鏡下觀察心肌組織病理學(xué)改變。

1.3.5 心肌組織炎癥因子及HIF-1α 水平測(cè)定取出-80 ℃液氮中的心肌組織，化凍后放入體積比為1：5 的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行組織勻漿形成勻漿液，然后將勻漿液放置在4 ℃下，以離心半徑為22.5 cm、3 000 r/min 離心10 min，吸取上清液，采用ELISA 法測(cè)定心肌組織中炎癥因子（IL-6、TNF-α、NF-κB）及HIF-1α 的水平，測(cè)定過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.6 心肌細(xì)胞中PI3K/Akt/HIF-1α 表達(dá)水平測(cè)定 取吸除上清液的心肌組織懸液，加入500 μL磷酸鹽緩沖液，3 000 r/min 離心5 min，棄上清液，加入3 mL 紅細(xì)胞裂解液，室溫裂紅5 min 后3 000 r/min 離心5 min，棄上清液。取100 μL 心肌細(xì)胞懸液，按照抗體說(shuō)明書(shū)的步驟和要求加入1 μL CD284（PI3K/Akt/HIF-1α）抗體，常溫避光孵育30 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)PI3K/Akt/HIF-1α表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠COHb、存活率及心肌損傷標(biāo)志物水平比較 見(jiàn)表1。

由表1 可見(jiàn)，4組大鼠存活率、AST、LDH、CK、CK-MB 水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。4組大鼠COHb 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。紅景天苷組、合并激動(dòng)劑組大鼠存活率高于對(duì)照組、合并拮抗劑組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。紅景天苷組、合并激動(dòng)劑組AST、LDH、CK、CK-MB 水平均低于對(duì)照組、合并拮抗劑組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 4組大鼠COHb、存活率及心肌損傷標(biāo)志物水平比較

2.2 4組大鼠心肌組織病理學(xué)改變 見(jiàn)圖1。

由圖1 可見(jiàn)，紅景天苷組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，組織間充血，肌纖維排列尚整齊，未見(jiàn)肌纖維斷裂。合并拮抗劑組部分肌纖維斷裂，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，組織間充血。合并激動(dòng)劑組肌纖維排列較整齊，見(jiàn)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)明顯出血。對(duì)照組肌纖維排列紊亂，部分肌纖維斷裂，組織間大量紅細(xì)胞滲漏，可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)及部分細(xì)胞水腫。

圖1 4組大鼠HE 染色心肌組織病理學(xué)改變（A：紅景天苷組；B：合并拮抗劑組；C：合并激動(dòng)劑組；D：對(duì)照組。黑色箭頭指炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，灰色箭頭指出血，白色箭頭指肌纖維斷裂，×10）

2.3 4組大鼠心肌組織炎癥因子及HIF-1α 水平比較 見(jiàn)表2。

由表2 可見(jiàn)，4組大鼠IL-6、TNF-α、NF-κB、HIF-1α 水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。與對(duì)照組、合并拮抗劑組比較，紅景天苷組和合并激動(dòng)劑組IL-6、TNF- α、NF-κB 水平較低，HIF-1α 水平較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與合并激動(dòng)劑組比較，紅景天苷組IL-6、TNF-α、NF-κB 水平較高，HIF-1α 水平較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表2 4組大鼠心肌組織炎癥因子及HIF-1α 水平比較（ng/mL）

2.4 4組大鼠心肌細(xì)胞PI3K/Akt/HIF-1α 表達(dá)水平比較 見(jiàn)圖2。

由圖2 可見(jiàn)， 紅景天苷組大鼠心肌細(xì)胞PI3K/Akt/HIF-1α 表達(dá)水平為（18.83±0.13）%，合并拮抗劑組表達(dá)水平為（5.92±0.33）%，合并激動(dòng)劑組表達(dá)水平為（20.60±0.32）%，對(duì)照組表達(dá)水平為（6.62±0.08）%。與對(duì)照組、合并拮抗劑組比較，紅景天苷組和合并激動(dòng)劑組PI3K/Akt/HIF-1α 表達(dá)水平較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與合并激動(dòng)劑組比較，紅景天苷組PI3K/Akt/HIF-1α 表達(dá)水平較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 4組大鼠心肌細(xì)胞磷脂酰肌醇-3- 激酶（PI3K）/ 蛋白激酶B（Akt）/ 缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）表達(dá)水平比較（A：紅景天苷組；B：合并拮抗劑組；C：合并激動(dòng)劑組；D：對(duì)照組）

3 討論

紅景天苷是藏藥紅景天的提取物，我國(guó)古時(shí)對(duì)紅景天的應(yīng)用在藏醫(yī)《四部醫(yī)典》和《本草綱目》均有記載。近年多項(xiàng)研究表明，紅景天苷有心臟保護(hù)作用，可以抑制心肌細(xì)胞的變性、壞死和凋亡，減弱心臟缺血再灌注損傷，增加心肌存活率，減少心肌凋亡，從而改善心臟功能[7-8]。ACOP 的機(jī)制為CO 與血液中的血紅蛋白結(jié)合，形成COHb，進(jìn)而引起各器官、組織缺氧，而心肌是常累積的器官之一。前期研究結(jié)果已證實(shí)，紅景天苷對(duì)ACOP 導(dǎo)致的心肌損傷有保護(hù)作用[4]。

本研究結(jié)果顯示，紅景天苷組存活率較高，AST、LDH、CK、CK-MB 水平較低，心肌細(xì)胞炎癥浸潤(rùn)、出血、肌纖維損傷較輕，心肌組織IL-6、TNF-α、NF-κB 水平較低，HIF-1α 表達(dá)水平較高；合并拮抗劑組不但未表現(xiàn)出單純給予紅景天苷治療的效果，而且其心肌損傷程度和對(duì)照組相似，同時(shí)HIF-1α 表達(dá)水平較低，而合并激動(dòng)劑組存活率較高，心肌酶升高程度較低，心肌細(xì)胞接近正常大鼠，心肌組織IL-6、TNF-α、NF-κB 水平較低，同時(shí)HIF-1α 表達(dá)水平較高。本研究證實(shí)，PI3K/Akt 通路激活、拮抗對(duì)HIF-1α 表達(dá)起到了關(guān)鍵性作用。

有關(guān)研究顯示，PI3K/Akt 信號(hào)通路在心臟功能調(diào)節(jié)和代謝過(guò)程中扮演著重要的角色，HIF-1α 是HIF-1 的激活亞基，是PI3K/Akt 信號(hào)通路的下游調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，是適應(yīng)缺氧環(huán)境的調(diào)節(jié)器，可以通過(guò)增強(qiáng)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)調(diào)節(jié)血管生成影響HIF-1α蛋白表達(dá)水平，機(jī)體在遭受低氧刺激后，HIF-1α 水平會(huì)出現(xiàn)改變[9-10]。這與本研究中PI3K/Akt 通路激活、拮抗對(duì)HIF-1α 影響相一致。

該實(shí)驗(yàn)對(duì)4組大鼠心肌細(xì)胞懸液中PI3K/Akt/HIF-1α 表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，紅景天苷組PI3K/Akt/HIF-1α 表達(dá)明顯增加，合并拮抗劑組接近于對(duì)照組，而合并激動(dòng)劑組最高，這也與ACOP 大鼠存活率、心肌損傷程度、炎癥因子表達(dá)相一致。

紅景天苷作為一種應(yīng)用較久的中藥，對(duì)心肌損傷保護(hù)作用的研究一直沒(méi)有間斷過(guò)。但是各項(xiàng)研究大部分是表述其治療作用，作用機(jī)制尚未完全明了。文獻(xiàn)顯示，對(duì)于ACOP，臨床常用高壓氧、醒腦藥物治療，而對(duì)心肌損傷治療的藥物卻比較少[11-12]。紅景天苷對(duì)ACOP 中毒心肌損傷鮮有研究，這也是本研究設(shè)立的原由和初衷。

綜上所述，本研究證實(shí)了紅景天苷對(duì)ACOP 心肌損傷的保護(hù)作用，同時(shí)，PI3K/Akt 通路在該治療過(guò)程中起到了至關(guān)重要的作用，至于是否有其他途徑并存，有待于進(jìn)一步研究。