許亦真

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)山東省分析測(cè)試中心, 山東 濟(jì)南 250014)

番石榴(PsidiumguajavaL.)是一種適應(yīng)性非常強(qiáng)的熱帶果樹，又稱那拔、番桃樹等，屬桃金娘科[1]。該果樹原產(chǎn)于南美洲，在中國(guó)華南地區(qū)亦有大面積的人工培植或野生品種。番石榴果實(shí)可供鮮食，番石榴葉含有揮發(fā)油及結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的多元酚類化合物等，可作為中藥使用，有消除痢疾、止血、清熱、健脾胃等功效[2-3]。番石榴葉經(jīng)煮沸后可去掉單寧等鞣酸組分，將其曬干后，可制作成茶葉，味甘，有清熱之效。大量臨床試驗(yàn)結(jié)果表明[4-8]，番石榴葉具有顯著的降糖降壓、抗氧化、抗菌等功效，同時(shí)含有多種維生素以及礦物質(zhì)元素。其中，傅予等[6]對(duì)番石榴葉中總黃酮的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究，并以小鼠為模型，考察了番石榴葉的降糖特性，驗(yàn)證了其對(duì)維持糖尿病小鼠正常血糖水平的積極效應(yīng)。

目前，對(duì)于番石榴果實(shí)中化學(xué)組分的研究相對(duì)比較全面，但對(duì)于葉中化學(xué)組分的研究及其作為中藥等的藥代動(dòng)力學(xué)研究相對(duì)較少。已有研究證明番石榴葉藥理活性顯著，其中沒食子酸等酚酸類、黃酮類、三萜酸、倍半萜類等物質(zhì)具有極強(qiáng)的抗氧化和抗炎作用，同時(shí)具有一定降糖作用[9-11]。因此，對(duì)番石榴葉中揮發(fā)油組分的定性分析具有重要意義，可以為其作為中藥的開發(fā)利用提供重要的數(shù)據(jù)支持[12-13]。

Arthur等[14]提出的固相微萃取技術(shù)(solid phase microextraction, SPME)，最初主要用于分析環(huán)境中的有機(jī)污染物，后來(lái)經(jīng)過(guò)發(fā)展，在食品、藥品等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。該技術(shù)集采樣、萃取、濃縮和進(jìn)樣于一體，操作簡(jiǎn)單且高效，富集效果優(yōu)異。白麗麗等[15]采用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析了番石榴果實(shí)中的揮發(fā)性組分，并采用面積歸一化法計(jì)算了各組分的相對(duì)含量。本研究采用固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)番石榴葉中揮發(fā)油組分進(jìn)行分析鑒定，并通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)固相微萃取的條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 儀器與材料

Agilent 7890A-5973N氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)，MS105型微量分析天平(Mettler Toledo儀器公司)，100～1000 μL移液器(編號(hào)429358A，德國(guó)Eppendorf公司)，超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，HH-420 恒溫水浴鍋(上海一科儀器有限公司)，Millipore超純水系統(tǒng)(美國(guó)Merck Millipore公司)，SPME手動(dòng)進(jìn)樣手柄、碳分子篩羧乙基/二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷(CAR /DVB/PDMS)(50 μm)、聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯PDMS/DVB(65 μm)、聚丙烯酸酯PA(85 μm)、聚二甲基硅氧烷PDMS (100 μm)固相微纖維(美國(guó)Superlco公司)。

番石榴葉樣品，2018年采集于云南省玉林市，經(jīng)過(guò)洗滌、晾曬、粉碎并過(guò)20目金屬網(wǎng)篩，備用；正己烷、甲醇(色譜純、國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；氯化鈉(分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水(18.2 MΩ·cm)。

2 方法與條件

2.1 樣品處理

番石榴葉樣品經(jīng)過(guò)粉碎，過(guò)20目金屬網(wǎng)篩，稱取1.0 g待測(cè)粉末樣品置于20 mL頂空瓶中，加入5 mL超純水，密封并壓蓋。頂空固相微萃取溫度為70 ℃，時(shí)間為40 min，解析時(shí)間為5 min。

2.2 氣相色譜分析

目標(biāo)化合物通過(guò)Agilent DB-5 ms(30 m×250 μm,0.5 μm)色譜柱進(jìn)行分離，升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?0 ℃，保持2 min，以5 ℃/ min升至140 ℃保持1 min，再以10 ℃/min升至280 ℃保持10 min。進(jìn)樣口溫度280 ℃。采用不分流進(jìn)樣模式。載氣為高純氦氣，流速為1.0 mL/min。

采用NIST 2017數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行化合物的鑒定。離子源為電子電離源(EI)，電離能量為70 eV，溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，傳輸線溫度為300 ℃。掃描模式為全掃描，范圍29～600m/z。

固相微萃取纖維老化與空白試驗(yàn)：將固相微萃取纖維插入氣相色譜進(jìn)樣口中老化，進(jìn)樣口溫度設(shè)定為各固相微萃取纖維的最高耐受溫度以下10 ℃，直至沒有雜質(zhì)峰被檢測(cè)出來(lái)。取5 mL超純水，加入適當(dāng)氯化鈉，配置成空白對(duì)照溶液，對(duì)空白對(duì)照溶液進(jìn)行頂空分析，色譜圖為空白對(duì)照譜圖。

2.3 萃取條件優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取對(duì)萃取效果有明顯影響的因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以總出峰數(shù)目及總峰面積為因變量，對(duì)各因素進(jìn)行優(yōu)化。各試驗(yàn)參數(shù)設(shè)計(jì)如下：(1) 固相微萃取纖維為CAR/DVB/PDMS (50 μm)、PDMS (100 μm)、PDMS/DVB (65 μm)、PA (85 μm)；(2) 萃取溫度 20、35、50、65、80 ℃；(3) 萃取時(shí)間 10、20、30、40、50 min；(4) 樣品溶液的離子強(qiáng)度 (氯化鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 0、5%、10%、15%、20%、25%、30%。

3 結(jié)果與討論

3.1 固相微萃取纖維的選擇

分別對(duì)Superlco的4種不同的萃取纖維進(jìn)行對(duì)比，以每種萃取纖維提取出來(lái)的目標(biāo)峰數(shù)目為依據(jù)，對(duì)其萃取能力進(jìn)行評(píng)價(jià)分析。其他萃取條件分別為：萃取溫度80 ℃，萃取時(shí)間50 min，樣品溶液的離子強(qiáng)度為0。結(jié)果見圖1。CAR/DVB/PDMS混合涂層的固相微萃取纖維能夠提取出69種化合物，PDMS/DVB、PDMS分別提取出了60和44種化合物，而PA涂層的固相微萃取纖維僅能夠提取29種化合物。因此，采用CAR/DVB/PDMS固相微萃取纖維對(duì)番石榴葉中的揮發(fā)油物質(zhì)進(jìn)行提取。

圖1 固相微萃取纖維對(duì)萃取效率的影響Fig.1 Effects of sorbents of SPME fiber on the extraction efficiency

3.2 萃取溫度的優(yōu)化

提高萃取溫度有利于植物組織中揮發(fā)性組分揮發(fā)至頂層空氣中，對(duì)萃取過(guò)程有積極影響。其他萃取條件分別為：萃取涂層為CAR/DVB/PDMS，萃取時(shí)間50 min，樣品溶液的離子強(qiáng)度為0。通過(guò)圖2可以看出，溫度從20～80 ℃的遞增過(guò)程中，提取的總化合物個(gè)數(shù)和總峰面積均在不斷增長(zhǎng)?？紤]到溫度提升至80 ℃，對(duì)萃取效率的提升沒有太多積極影響，反而溫度過(guò)高容易導(dǎo)致某些物質(zhì)產(chǎn)生化學(xué)變化。因此，本試驗(yàn)中以65 ℃作為最優(yōu)萃取溫度。

圖2 固相微萃取溫度對(duì)萃取效率的影響Fig.2 Effects of sorbents of SPME extraction temperature on the extraction efficiency

3.3 萃取時(shí)間的優(yōu)化

由于萃取時(shí)間的改變對(duì)提取目標(biāo)物個(gè)數(shù)的影響沒有對(duì)總峰面積的影響大，因此，以總峰個(gè)數(shù)和總峰面積的變化為依據(jù)，選擇最優(yōu)的萃取時(shí)間。其他萃取條件分別為：萃取涂層為CAR/DVB/PDMS，萃取溫度65 ℃，樣品溶液的離子強(qiáng)度為0。從圖3中可以看出，隨著萃取時(shí)間的不斷增長(zhǎng)，總峰面積和總峰個(gè)數(shù)也隨之不斷增加，并在40 min的時(shí)候達(dá)到最高。故選擇40 min作為最優(yōu)萃取時(shí)間。

圖3 固相微萃取時(shí)間對(duì)萃取效率的影響Fig.3 Effects of sorbents of SPME extraction time on the extraction efficiency

3.4 離子強(qiáng)度的優(yōu)化

由于鹽析效應(yīng)的存在，特定情況下加入一定量的無(wú)機(jī)鹽能夠促進(jìn)一些物質(zhì)從溶液中分離出來(lái)或者揮發(fā)出來(lái)。本試驗(yàn)采用氯化鈉作為鹽析劑，并以總峰個(gè)數(shù)和總峰面積的變化為依據(jù)來(lái)選擇最優(yōu)的鹽析劑加入量。其他萃取條件分別為：萃取涂層為CAR/DVB/PDMS，萃取溫度65 ℃，萃取時(shí)間40 min。從圖4中可以看出，在樣品溶液的離子強(qiáng)度(氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù))為20%的條件下，結(jié)果最優(yōu)。

圖4 固相微萃取離子強(qiáng)度對(duì)萃取效率的影響Fig.4 Effects of sorbents of SPME ionic strength on the extraction efficiency

通過(guò)優(yōu)化試驗(yàn)得出最優(yōu)的試驗(yàn)條件為：CAR/DVB/PDMS萃取纖維；萃取溫度65 ℃；萃取時(shí)間40 min；離子強(qiáng)度20%。

3.5 揮發(fā)油組分分析

通過(guò)GC/MS分析，最多可以分離出70個(gè)色譜峰，其中能夠通過(guò)美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所(National Institute of Standards and Technology,NIST)譜庫(kù)鑒定出化合物結(jié)構(gòu)的有47個(gè)，其相對(duì)含量占總揮發(fā)油組分含量的93.93%。色譜圖以及鑒定出的化合物分別見圖5和表1。

表1 番石榴葉中揮發(fā)油組分及含量

續(xù)表1

圖5 番石榴葉揮發(fā)油組分總離子流圖Fig.5 The total ion chromatogram of volatile compounds in guava leaves

經(jīng)過(guò)NIST譜庫(kù)分析，鑒定出的47種化合物中麥芽酚的含量相對(duì)較高，占總揮發(fā)性及半揮發(fā)性組分含量的10.65%。相對(duì)含量較高的化合物有二氫獼猴桃內(nèi)酯(7.69%)、石竹烯(6.06%)、植酮(5.39%)、1-(4-叔丁基苯基)丙-2-酮(4.36%)、咕吧烯(4.00%)、芳樟醇(3.42%)、棕櫚酸甲酯(3.14%)、α-紫羅蘭酮(3.08%)以及2-十三碳烯醛(3.06%)。根據(jù)化合物基團(tuán)的不同進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其中酮類化合物有8種，其相對(duì)含量最高，占總含量的18.82%；醛類化合物共有14種，占總含量的17.95%；酯類化合物共有5種，占總含量的14.41%；醇類化合物共有6種，占總含量的11.37%；烯烴類化合物共有4種，占總含量的13.43%，酸類化合物共有2種，占總含量的1.58%；剩余酚類等其他化合物共有8種，占總含量的16.41%。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究通過(guò)固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜法提取了番石榴葉中的揮發(fā)油組分，共鑒定出47種有機(jī)化合物，占總揮發(fā)油組分含量的93.95%。鑒定出的主要組分有麥芽酚、二氫獼猴桃內(nèi)酯、石竹烯、植酮、1-(4-叔丁基苯基)丙-2-酮、咕吧烯、芳樟醇、棕櫚酸甲酯、α-紫羅蘭酮和2-十三碳烯醛，其相對(duì)含量均大于3%。鑒定出來(lái)的酮類化合物有8種，其相對(duì)含量最高，占18.82%；其余依次為醛類 (17.95%)、酯類 (14.41%)、烯烴類(13.43%)、醇類 (11.37%)、酸類 (1.58%)和酚類 (10.65%)。其他類化合物共有8種，占總含量的16.41%。其中，多種化合物具有一定的降糖、降血壓等藥用價(jià)值。綜上所述，該方法對(duì)番石榴葉中揮發(fā)油組分的分析效果良好，可為番石榴葉藥用價(jià)值的研究提供方法及數(shù)據(jù)支持。