呂寒寧，郝圩茜，田 欣，任雨荷，何 軍

（商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛726000）

黃秋葵（Abelmoschus esculentus（Linn.）Moench）為錦葵科秋葵屬一年生草本植物［1］，其植株富含維生素A、維生素B、維生素C以及鐵、鉀、磷、鋅、鈣等微量元素，還有多糖、黃酮、木酯素等多種化學(xué)成分，具有增強身體耐力、抗疲勞和強腎補虛的作用，被列入21世紀(jì)最佳綠色食品名錄之中［2-4］。其富含的生物類黃酮能有效地清除體內(nèi)的自由基，具有很強抗氧化能力［5］。

作為一種藥食同源的植物，秋葵的總黃酮含量較高，約為2.8%［6］，且應(yīng)用前景十分廣闊，具有極大的開發(fā)價值，長期以來受到人們的關(guān)注，成為科技工作者研究的熱點。本研究以黃秋葵為材料，在傳統(tǒng)醇提工藝的基礎(chǔ)上，應(yīng)用超聲技術(shù)輔助提取黃酮，以期為商洛市中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

黃秋葵，2019年采自商洛市丹鳳縣棣花鎮(zhèn)鞏家河村，60℃烘干，除雜，粉碎，過60目篩備用。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購自合肥博美生物科技有限公司，NaNO2、Al（NO3）3、NaOH、無水乙醇均為分析純。

1.2 主要儀器

XFB-200高速中藥粉碎機，吉首中誠制藥機械廠；KQ-250E超聲波清洗機，昆山禾創(chuàng)設(shè)備制造廠；RGL-20bR離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-1780紫外分光光度計，日本島津儀器有限公司；SI-2002電子分析天平，北京市丹佛器材有限公司；DHG-9123A恒溫加熱干燥箱，上海市齊欣儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制使用電子分析天平精準(zhǔn)稱量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，置于50 mL燒杯中加入少量70%乙醇并用玻璃棒攪拌溶解，然后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，洗滌3次燒杯，加入70%乙醇至刻度線，配制質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液于10 mL容量瓶中，依次加入0.7 mL NaNO2溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%）以及0.7 mL Al（NO3）3溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%），最后加入2 mL NaOH溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%），2次加入試劑間隙均用玻璃棒攪拌并靜置。最后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的乙醇定容到10 mL，靜置20 min使之充分混勻后于510 nm波長處測吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度為x軸、吸光度為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 黃酮提取液的制備精準(zhǔn)稱取黃秋葵2.5 g于250 mL錐形瓶中，按一定料液比加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，在一定溫度下進行一定時間的超聲波提取，減壓抽濾，蒸發(fā)濃縮，除去乙醇，即得樣品溶液。

1.3.3 黃酮得率的計算取黃酮提取樣液1 mL于10 mL容量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法制備樣液后，在波長510 nm處測定吸光度，所得數(shù)據(jù)代入式（1）中計算黃酮得率。

式中，C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算得到的黃酮提取樣液濃度（mg/mL）；V為蒸發(fā)濃縮后的體積（mL）；M為黃秋葵干粉質(zhì)量（g）；10為稀釋倍數(shù)。

1.3.4 單因素試驗與正交試驗

1）乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮得率的影響：在浸提時間25 min、浸提溫度70℃、料液比1∶25的條件下，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別設(shè)定為50%、60%、70%、80%。

2）料液比對黃酮得率的影響：在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、浸提時間25 min、浸提溫度70℃的條件下，料液比分別設(shè)定為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35。

3）浸提時間對黃酮得率的影響：在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶25、浸提溫度70℃的條件下，浸提時間分別設(shè)定為20、25、30、35 min。

4）浸提溫度對黃酮得率的影響：在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶25、提取時間25 min的條件下，浸提溫度分別設(shè)定為50、60、70、80℃。

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，每個因素里面選擇對總黃酮提取率影響較大的3個水平，以總黃酮提取率為檢測指標(biāo)，設(shè)計L9（34）正交試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)試驗測定結(jié)果，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=12.017x-0.024 3，R2=0.992 5。其中y為吸光度，x為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mg/mL）。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮得率的影響由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，黃酮得率呈先上升后下降的趨勢，在70%乙醇體積分?jǐn)?shù)時，黃酮得率達到峰值，為2.01%；70%乙醇體積分?jǐn)?shù)之后，黃酮得率開始下降，可能是因為其他物質(zhì)的提取率也相應(yīng)增高而影響了黃酮得率，因此選擇60%、70%、80%作為正交試驗的3個水平條件。

2.2.2 浸提溫度對黃酮得率的影響由圖3可知，隨著浸提溫度的升高，黃酮得率呈先上升后下降的趨勢，在浸提溫度為70℃時，黃酮得率達到最大值，為2.30%；超過70℃后黃酮得率開始下降，可能是因為高溫條件破壞了黃酮化合物的穩(wěn)定性，因此選擇60、70、80℃為正交試驗的3個水平條件。

圖3 浸提溫度對黃酮得率的影響

2.2.3 料液比對黃酮得率的影響由圖4可知，隨著提取液的增加，黃酮得率呈先上升后緩慢下降的趨勢，在料液比1∶30時，黃酮得率達到峰值，為2.30%；料液比在1∶35時黃酮得率有所下降，原因可能是隨著乙醇溶液體積的不斷增大，使黃秋葵中的其他物質(zhì)也溶解出來，阻礙了總黃酮的溶出，因此選擇1∶25、1∶30、1∶35為正交試驗的3個水平條件。

圖4 料液比對黃酮得率的影響

2.2.4 浸提時間對黃酮得率的影響由圖5可知，隨著浸提時間的增加，黃酮得率呈先快速上升后緩慢下降的趨勢，在浸提時間為30 min時，黃酮得率達到峰值，為2.35%；30 min之后黃酮提取率逐漸緩慢下降，可能是因為黃酮化合物在長時間提取過程中逐漸被分解，因此選擇25、30、35 min為正交試驗的3個水平條件。

圖5 浸提時間對黃酮得率的影響

2.3 正交試驗結(jié)果

2.3.1 因素與水平基于單因素試驗結(jié)果，確定以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、浸提時間（C）、浸提溫度（D）4個因素作為考察對象，以總黃酮得率作為考察指標(biāo)，進行L9（34）正交試驗，各因素與水平見表1所示。

表1 因素與水平

2.3.2 正交試驗結(jié)果按照表2進行正交試驗，以黃酮得率作為考察指標(biāo)，結(jié)果如下所示。

表2 正交試驗方案及結(jié)果

由表2可知，4個因素對黃酮得率的影響大小順序為：乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）＞料液比（B）＞浸提溫度（D）＞提取時間（C），其最佳的組合為A2B2C3D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶25、浸提時間30 min、浸提溫度80℃。以最優(yōu)參數(shù)進行驗證試驗，并重復(fù)3次，黃酮的平均得率為2.41%。

2.4 方差分析結(jié)果

利用Minitab軟件進行方差分析，結(jié)果如表3所示。使用FINV函數(shù)公式計算臨界值后得F0.05=6.59，F(xiàn)0.1=4.19。A因素F值＞F0.05有顯著意義，B和D因素F值介于F0.05和F0.1之間，有較顯著意義，C因素F值＜F0.1無意義。方差分析結(jié)果確保了直觀分析得出的結(jié)論正確性，因此驗證了最佳提取組合條件為A2B2C3D3。

表3 方差分析結(jié)果

3 小結(jié)與討論

本研究以黃秋葵為原材料，采用超聲輔助醇提的方法提取其黃酮類化合物，通過單因素試驗和正交試驗的方法，確定提取黃酮類化合物的最佳工藝條件為乙醇60%、料液比1∶25、浸提時間30 min、浸提溫度80℃，在此條件下黃酮提取率為2.41%。

黃酮類化合物普遍存在于植物的花、葉、果等組織中，多以苷的形式存在，水提和醇提是經(jīng)典的傳統(tǒng)提取方法［7-10］，水提取法的優(yōu)點在于操作簡便、成本低，適合大量生產(chǎn)，但缺點也十分明顯，其提取化合物的雜質(zhì)較多；醇提法的優(yōu)點較多，如用量少、提取時間短、雜質(zhì)少和提取完全等。本研究在傳統(tǒng)醇提法基礎(chǔ)上對其工藝進行了優(yōu)化，輔以超聲處理在一定程度上提高了黃酮的提取效率［11］，經(jīng)過3次重復(fù)試驗，總黃酮得率為2.41%。與張澤生等［12］在黃秋葵中多酚和黃酮提取工藝的研究相比較，本研究的提取液和乙醇濃度均低于前者，但得率相差不大。

除了傳統(tǒng)的提取方法之外，還有許多現(xiàn)代的提取方法，比如超臨界CO2萃取技術(shù)［13］，其優(yōu)點是黃酮的提取率很高且無“三廢”，但投資較大、對操作人員的要求高、運行成本高、不經(jīng)濟。因此本研究的新工藝具有綜合成本低、對人員和設(shè)備要求低、操作簡便等特點，并且污染較小、提取效率較高，適用于商洛市這種經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)，可以為當(dāng)?shù)刂兴幃a(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)參考，對毗鄰該地區(qū)的相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展也有一定的借鑒作用。