李育剛，許晴晴，魏珊珊

成纖維細胞激活蛋白-α(fibroblast activation protein-α, FAP-α)是一種新發(fā)現(xiàn)的促腫瘤生長因子，在腫瘤生長、浸潤和轉移、內皮細胞增殖以及新生血管生成等多種生物學行為中發(fā)揮重要作用[1]。現(xiàn)階段FAP-α已被證實在肺癌、食管癌以及胃癌等腫瘤中高表達，與患者預后密切相關，而FAP-α在結直腸癌中的研究較少[2-4]。本實驗采用免疫組化ELPS法檢測FAP-α蛋白在結直腸癌組織中的表達，探討其與結直腸癌臨床病理特征的相關性及患者預后的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取TCGA數(shù)據(jù)庫來源的結直腸癌組織中l(wèi)evel 3 HTSeq-FPKM格式的數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)作為在線數(shù)據(jù)庫研究對象，包含698例結直腸癌標本。選取2015年4月～2017年4月我院存檔的118例結直腸癌術后病理切片和臨床資料。所有患者通過電話或門診隨訪3年，隨訪截至2020年4月30日。其中男性68例，女性50例，年齡42～68歲，平均(54.42±5.12)歲。同時選取上述病例中30例結直腸癌患者的癌旁組織，納入28例混合痔患者術后正常黏膜組織和31例內鏡下行結直腸息肉切除術后的結直腸腺瘤組織，作為對照組。本實驗通過鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院倫理委員會審核給予免除簽署知情同意書。納入標準：(1)結合臨床特點及術后病理明確診斷為原發(fā)性結直腸癌。(2)既往未曾罹患腫瘤或自身免疫性疾病。(3)術后生存時間≥3個月，有完整的臨床隨訪資料。排除標準：(1)合并其他類型腫瘤；(2)未行結直腸癌根治術；(3)術前曾接受過放、化療或中醫(yī)治療；(4)腫瘤以外其他原因導致的患者死亡。

1.2 方法

1.2.1樣品采集及保存 結直腸癌、癌旁、正常黏膜和腺瘤組織標本，均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，用于免疫組化染色。

1.2.2生物信息學數(shù)據(jù)庫分析 通過基因表達譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析(GEPIA)網站(http: //gepia2.cancer-pku.cn)分析FAP-α在結直腸癌中的表達水平[5]。以FAP-α中位水平為界分為FAP-α低表達和FAP-α高表達，使用survminer和survival R語言包進行生存資料的預后分析[6]。

1.2.3免疫組化 采用免疫組化ELPS法檢測結直腸癌、癌旁、正常黏膜、腺瘤組織中FAP-α的表達。操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行，將5 μm厚的組織切片脫蠟水化，用3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶活性，在檸檬酸(pH 6.0，0.01 mol/L，95 ℃)中加熱15 min，然后緩慢冷卻修復抗原。封閉液37 ℃孵育30 min，加入anti-FAP-α抗體4 ℃過夜。次日加二抗37 ℃孵育20 min，經二氨基聯(lián)苯胺法顯色，蘇木精復染后，脫水封固定，熒光倒置生物顯微鏡下觀察陽性染色程度。由至少兩位病理醫(yī)師對陽性細胞染色強度和陽性細胞百分比進行獨立評估：(1)根據(jù)陽性細胞染色強度評分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)根據(jù)陽性染色細胞百分比評分：陽性細胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項得分結果相乘：0～4分為低表達，5～10分為高表達。

1.2.4主要試劑與儀器 甲醛、HE染液，購自上海谷研公司。二氨基聯(lián)苯胺、3%過氧化氫，購自上海研生公司。anti-FAP-α抗體購自上海戶實公司，生物組織包埋機購自濟南歐萊博公司，熒光倒置生物顯微鏡購自賽默飛世爾公司。

1.2.5觀察指標 比較正常黏膜組織、癌旁組織、腺瘤組織和結直腸癌組織中FAP-α的表達；FAP-α表達與結直腸癌臨床病理特征之間的相關性；分析FAP-α表達與患者預后的相關性。

2 結果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫結直腸癌組織中FAP-α的表達TCGA數(shù)據(jù)庫分析顯示，與正常組織相比，F(xiàn)AP-α在結直腸癌組織中的表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1A)。預后生存曲線分析顯示，F(xiàn)AP-α低表達組的預后顯著優(yōu)于FAP-α高表達組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1B)。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫結直腸癌組織中FAP-α的表達(A)及預后分析(B)

2.2 不同結直腸組織中FAP-α的表達免疫組化結果顯示，結直腸癌組織中FAP-α高表達組75例，F(xiàn)AP-α低表達組43例。結直腸癌組織中FAP-α的免疫組化得分顯著高于正常黏膜組織、癌旁組織、腺瘤組織，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。癌旁組織中的FAP-α的免疫組化得分亦顯著高于正常黏膜組織和腺瘤組織，差異均有統(tǒng)計學意義(t=14.01，t=6.64，P<0.05，表1，圖2)。

表1 結直腸癌組織、正常黏膜組織、癌旁組織及腺瘤組織中FAP-α的表達[n(%)]

ABCDE圖2 不同結直腸組織中FAP-α的表達:A.正常黏膜組織中FAP-α不表達;B.癌旁組織中少數(shù)細胞弱表達FAP-α;C.腺瘤間質中少數(shù)細胞中等強度表達FAP-α;D.結直腸癌組織中FAP-α低表達;E.結直腸癌組織中FAP-α高表達,ELPS法

2.3 結直腸癌組織中FAP-α蛋白表達與臨床病理特征的關系相關性分析結果顯示，F(xiàn)AP-α表達與結直腸癌淋巴結轉移和脈管侵犯有關，高表達組的淋巴結轉移和脈管侵犯的比例均顯著高于低表達組(χ2=21.912，χ2=5.591，P均<0.05)，其表達與患者年齡、性別、BMI、ECOG評分、原發(fā)灶部位、浸潤深度、腫瘤直徑、分化程度、神經侵犯、病理分型、RAS突變、手術時間均無關(P均>0.05，表2)。

表2 結直腸癌組織中FAP-α表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

2.4 結直腸癌中FAP-α表達與患者預后的關系術后隨訪3年，F(xiàn)AP-α高表達組患者的病死率為37.33%，F(xiàn)AP-α低表達組患者的病死率為18.6%，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.033)。結直腸癌患者的平均總生存期(overall survival, OS)為(30.12±5.26)個月，平均無進展生存期(progression-free survival, PFS)為(28.32±5.51)個月。Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示，F(xiàn)AP-α高表達組的OS顯著低于FAP-α低表達組(t=5.232，P<0.001，圖3)。此外，F(xiàn)AP-α高表達組患者的PFS亦顯著低于FAP-α低表達組(t=5.317，P<0.001，圖4)。

圖3 Kaplan-Meier生存曲線分析FAP-α表達與結直腸癌患者總生存期的關系

圖4 Kaplan-Meier生存曲線分析FAP-α表達與結直腸癌患者無進展生存期的關系

3 討論

腫瘤相關纖維母細胞(tumor associated fibroblasts, CAF)是腫瘤微環(huán)境中最常見的腫瘤基質細胞之一。通過分泌細胞因子、生長因子、趨化因子和細胞外基質降解酶，促進炎癥途徑，破壞免疫監(jiān)視，重建細胞外基質，形成腫瘤生態(tài)，促進腫瘤細胞的生長和轉移。FAP-α是CAF的重要表面標志物，屬于脯氨酸特異性絲氨酸蛋白酶家族[1]。其在90%以上惡性上皮性腫瘤中高表達，但在多數(shù)正常組織中并不表現(xiàn)出FAP-α活性[2-4]。由于FAP-α特殊的蛋白質結構和生物學功能，被廣泛用作腫瘤檢測和預后評估的重要標志物[7]。本實驗擬結合TCGA數(shù)據(jù)庫檢測FAP-α在結直腸癌組織中的表達，并通過臨床標本進行驗證，探究FAP-α與臨床病理特征的相關性及預后價值。

本實驗結果顯示，F(xiàn)AP-α表達與淋巴結轉移和脈管轉移有關。這與既往研究相似，多項研究均證實FAP-α可能是腫瘤發(fā)生血管生成和淋巴結轉移的重要調控因子，如食管鱗狀細胞癌、腎細胞癌、胃癌等[3,8]。最近研究結果表明，F(xiàn)AP-α同時具有外肽酶和內肽酶活性，可以在細胞表面發(fā)揮蛋白水解酶活性，通過降解細胞外基質，促進腫瘤生長、浸潤轉移、淋巴管及血管生成，并且與FAP-α高表達細胞共培養(yǎng)，還可促進其他細胞類型(包括腫瘤、內皮細胞和免疫細胞)的增殖、活化和侵襲[9]。目前，F(xiàn)AP-α促進淋巴結轉移的機制尚未明確。淋巴結轉移主要取決于淋巴管的生成，通過腫瘤細胞浸潤到腫瘤內的淋巴管，然后到達附近的淋巴結。因此，淋巴管密度可能是淋巴結轉移和癌癥進展的敏感指標。Cheng等[10]的實驗結果證明，食管鱗癌中的CAF密度與腫瘤淋巴管密度的增加顯著相關。此外，血管生成也是腫瘤轉移的必不可少病理過程，微血管密度作為血管生成的定量指標被認為是評估血管生成活性的重要指標。Chen等[11]的實驗結果證實肺鱗狀上皮癌中FAP-α的表達與微血管密度和淋巴管密度之間均呈正相關。Cao等[12]的實驗結果亦證實FAP-α可以通過Akt和ERK信號通路促進結直腸癌的血管生成。作為對血管生成中起重要作用的血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，已經被證實與腫瘤淋巴管生成和淋巴結轉移有關[13]。由于FAP-α可以釋放VEGF刺激血管網絡的形成，因此FAP-α可能通過相同的機制誘導腫瘤的血管生成和淋巴管生成。

本實驗結果顯示，F(xiàn)AP-α表達與患者年齡、性別、BMI、ECOG評分、原發(fā)灶部位、浸潤深度、腫瘤直徑、分化程度、神經侵犯、病理分型、RAS基因突變、手術時間均無關；與術后生存期呈負相關。這與TCGA數(shù)據(jù)庫所獲取的預后分析結果相同，既往研究亦顯示多種腫瘤類型中FAP-α的表達具有預后價值，并且FAP-α本身可促進各種細胞類型的促腫瘤的增殖和轉移等功能[1]。Chen等[14]的研究結果顯示，在人結直腸癌樣本中，F(xiàn)AP-α高表達的CAF通過上調CCL2分泌、招募髓系細胞、降低T細胞活性，促進結直腸癌腫瘤免疫微環(huán)境中的免疫抑制，F(xiàn)AP-α高表達預示結直腸癌患者較低的生存期。此外，在其他腫瘤中亦證實，如胃癌中FAP-α高表達的病例亦顯示豐富的基因途徑，用于免疫調節(jié)、血管生成、細胞遷移以及細胞分化和生長，與胃癌分級、淋巴結和腹膜浸潤及OS差相關[15-16]。FAP-α在腫瘤組織中的過表達與不良OS和腫瘤淋巴結轉移之間的關系更緊密，尤其在結直腸癌或胰腺癌中更為顯著。FAP-α通過調節(jié)T細胞和腫瘤相關巨噬細胞抑制腫瘤免疫，進而在調節(jié)抗腫瘤免疫反應中起關鍵作用[17]，并且在適當?shù)谋尘昂蜋z測方法下FAP-α可以作為各種人類腫瘤類型中有價值的預后標志物。

綜上，本實驗結果顯示，結直腸癌組織中FAP-α表達上調，且與淋巴結轉移和脈管侵犯有關，對于結直腸癌預后有一定的參考價值。