雷 超，劉鋒軍，徐飛燕

（1.渭南市檢驗檢測研究院，陜西渭南 714000；2.陜西省發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，陜西渭南 714000）

氨基酸是含有氨基和羥基的一類有機化合物，是組成蛋白質(zhì)的基本單位[1]，對發(fā)酵產(chǎn)品而言，也是重要的風味物質(zhì)[2-3]，其含量的高低直接影響產(chǎn)品的口感和營養(yǎng)價值，在現(xiàn)有的酵素相關(guān)標準中，也明確規(guī)定了游離氨基酸的質(zhì)量指標[4-5]。本文通過采用不同前處理方法，對不同酵素樣品中游離氨基酸檢測方法進行比較分析，篩選出一種操作簡便，準確可靠的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨基酸混合標準溶液、茚三酮試劑套裝（Sykam公司）；甲醇、無水乙醇（色譜純，天津科密歐），其他試劑均為分析純；超濾離心裝置（截留分子量MWCO 10 000）；測試樣品為1#桑葚酵素原液，2#果蔬汁復(fù)合酵素，3#富平柿子酵素。

1.2 儀器與設(shè)備

S-433D全自動氨基酸分析儀（Sykam公司）；BT-224S電子天平（賽多利斯）；冷凍離心機（上海安亭）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

稱取0.5～2.0 g（精確至1 mg）混勻試樣，置于10.0 mL容量瓶中備用。按以下3種方法提取凈化。

方法A磺基水楊酸凈化法：加入2%（m/m）磺基水楊酸溶液溶解并定容至刻度，混勻后全部轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，渦旋振蕩1 min后靜置1 h，10 000 r/min離心15 min，取上清液過0.22 μm濾膜后上機分析。

方法B乙醇溶液凈化法：加入85%（v/v）乙醇溶液溶解并定容至刻度，混勻后全部轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，渦旋振蕩1 min后靜置1 h，10 000 r/min離心15 min，準確吸取上清液2.0 mL于表面皿中，40 ℃水浴蒸干。準確加入 2.0 mL樣品稀釋液溶解，過0.22 μm濾膜后上機分析。

方法C離心式超濾凈化法：加入超純水溶解并定容至刻度，超聲提取15 min，待溶液冷卻后吸取4mL樣液，通過0.22 μm濾膜后注入超濾離心管中，12 000 r/min離心 20 min，吸取超濾液2.0 mL于表面皿中，接下來同方法B。

1.3.2 儀器分析條件

色譜柱LCAK06/Na型；柱溫箱程序升溫，升溫程序為初始57 ℃保持22 min，然后以3.4 ℃/min升溫至74 ℃保持21 min，最后以3.4 ℃/min降溫至57 ℃并保持5 min；衍生泵流速0.25 mL/min；反應(yīng)器溫度130 ℃；檢測波長570 nm和440 nm；LC梯度洗脫由A、B、C、D 4個泵按比例完成，A泵為pH=3.45檸檬酸鈉緩沖溶液，B泵為pH=10.85檸檬酸鈉緩沖溶液，C泵為5%（v/v）甲醇水溶液，D泵為再生液（20.0 g/L氫氧化鈉標準溶液），4個泵梯度比例為：0～11.0 min A泵100%，11.1～17.0 min A泵85%、 B泵15%，17.1～27.0 min A泵67%、B泵33%，27.1～30.0 min A泵20%、B泵80%，30.1～42.0 min B泵100%，42.1～45.1 min D泵100%，45.2～58.3 min A泵100%；洗脫泵流速0.45 mL/min；進樣量50 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法檢出限

取100 nmol/mL標準工作溶液重復(fù)7次測定，17種氨基酸標準在43 min內(nèi)能全部分離，且分離度較高，峰型較好（見圖1）。逐步稀釋混合標準溶液，直至信噪比小于3。當取樣量為2 g時，該方法測定17種氨基酸的檢出限（3倍信噪比）在0.154～2.09 μg/100 g，定量限（10倍信噪比）在0.512～6.980 μg/100g，表明該儀器方法完全能夠滿足要求。

圖1 17種氨基酸標準色譜圖

2.2 準確度和精密度

按照前述方法分別做不同樣品的加標回收試驗，氨基酸混合標準溶液加標量100 μL（0.563 6 mg），同時測定其本底值，以氨基酸總量計算加標回收率，并計算多次的RSD值，結(jié)果見表1。

由表1可知，選取3個代表性樣品，采用A、B、C 3種前處理方法對樣品中游離氨基酸進行提取凈化，在給定的儀器條件下，上機測定17種游離氨基酸的總含量，平行測定3次，結(jié)果取平均值。結(jié)果表明，3種不同方法對于同一酵素樣品中游離氨基酸的檢測結(jié)果有一定差別，方法A檢測結(jié)果最高，且偏差較?。环椒˙檢測結(jié)果最低，偏差較大；方法C檢測結(jié)果僅次于方法A，因此從檢測結(jié)果上可以得出方法A的精確性更好。以方法A測定結(jié)果為例，3個酵素樣品均檢出17種游離氨基酸，其游離氨基酸總含量為：1#樣品0.257 g/100 g，含量較高；3#樣品 0.064 5 g/100 g，含量次之；2#樣品0.054 3 g/100 g，含量較低。經(jīng)實際檢測表明以桑葚、富平柿子等為主要原料，經(jīng)發(fā)酵工藝生產(chǎn)的酵素產(chǎn)品中游離氨基酸種類分布全面，含量 較高。

表1 3種不同前處理方法加標回收試驗結(jié)果及標準偏差表

3 結(jié)論

方法A平均加標回收率101.5%，RSD為0.70%，具有良好的準確度和精密度，適用于酵素樣品中游離氨基酸的快速準確定量分析；方法C具有無污染、環(huán)保等優(yōu)勢，但單個樣品檢測成本較高；方法B乙醇溶液能和氨基酸上的羧基發(fā)生酯化反應(yīng)生成水，使得其準確度和精密度較差，因此不適用于酵素產(chǎn)品中游離氨基酸的檢測。