黃秋萍，謝晨陽(yáng)，李新宇，金斌，曾榛,2，錢波,3，戴玲，宋家樂(lè),4,5,7*

-茶氨酸改善來(lái)曲唑誘導(dǎo)的多囊卵巢綜合征大鼠臨床癥狀

黃秋萍1，謝晨陽(yáng)1，李新宇1，金斌1，曾榛1,2，錢波1,3，戴玲6*，宋家樂(lè)1,4,5,7*

1. 桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西 桂林 541199；2. 中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410000；3. 廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，福建 廈門 361102；4. 廣西衛(wèi)生健康委員會(huì)全生命周期健康保健研究實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541199；5. 廣西環(huán)境暴露組學(xué)與全生命周期健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541199；6. 桂林醫(yī)學(xué)院大學(xué)生心理健康與咨詢中心，廣西 桂林 541199；7. 桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院臨床營(yíng)養(yǎng)科，廣西 桂林 541109

為探究-茶氨酸（-theanine，LTA）對(duì)來(lái)曲唑誘導(dǎo)的多囊卵巢綜合征（Polycystic ovarian syndrome，PCOS）大鼠臨床癥狀的改善效果。將28只雌性SD大鼠按每組7只隨機(jī)分為正常對(duì)照組、PCOS模型組、PCOS＋低劑量LTA組和PCOS＋高劑量LTA組。建模階段，除正常對(duì)照組以生理鹽水灌胃外，其余3組持續(xù)灌胃來(lái)曲唑28?d誘導(dǎo)PCOS模型。干預(yù)階段，正常對(duì)照組和PCOS模型組以生理鹽水持續(xù)灌胃，兩個(gè)LTA干預(yù)組大鼠分別持續(xù)灌胃對(duì)應(yīng)劑量LTA干預(yù)30?d。結(jié)果顯示，與PCOS模型組相比，LTA干預(yù)組大鼠血清中睪酮（Testosterone，T）、黃體生成素（Luteinizing hormone，LH）、胰島素（Insulin，INS）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白（Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）水平及胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）均顯著降低（<0.05），高密度脂蛋白（High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平均顯著升高（<0.05），黃體生成素與卵泡刺激素的比值（LH/FSH）、空腹血糖（Fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）和體重均有所下降（>0.05）；低劑量LTA干預(yù)組大鼠血清雌二醇（Estradiol，E2）顯著升高（<0.05）；高劑量LTA干預(yù)組大鼠卵泡刺激素（Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）顯著升高（<0.05）；LTA干預(yù)組大鼠的發(fā)情周期紊亂、卵巢組織多囊樣病變較PCOS模型組均有一定程度的改善。結(jié)果表明，LTA干預(yù)能有效調(diào)節(jié)PCOS大鼠性激素分泌、恢復(fù)發(fā)情周期規(guī)律變化和改善其卵巢多囊樣病變，同時(shí)顯著改善PCOS大鼠胰島素抵抗（Insulin resistance，IR）、血脂代謝紊亂并抑制異常水平的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）分泌。

-茶氨酸；多囊卵巢綜合征；高雄激素血癥；胰島素抵抗

多囊卵巢綜合征（Polycystic ovarian syndrome，PCOS）是一種育齡期女性常見(jiàn)的內(nèi)分泌紊亂疾病，發(fā)生率為5%～10%[1]。PCOS以高雄激素血癥（Hyperandrogenemia，HA）、胰島素抵抗（Insulin resistance，IR）、不孕不育、肥胖、多毛和多囊性卵巢等為主要臨床表現(xiàn)[2]。此外，PCOS患者普遍存在血脂代謝異常、氧化應(yīng)激及糖代謝異常所引起的代謝綜合征[2-3]。目前，使用化學(xué)合成藥物仍然是PCOS較為主流的治療方案之一，但這些主要的治療藥物如抗高雄激素血癥藥物、促排卵藥物和胰島素增敏劑在服用過(guò)程中易出現(xiàn)潮熱、頭暈、視力模糊、自限性的胃腸道不適和受精卵不易著床等不良反應(yīng)[4-5]。因此，尋找安全、有效且副作用小的天然植物基產(chǎn)品來(lái)代替化學(xué)合成藥物很可能是未來(lái)治療和管理PCOS的重要發(fā)展方向。-茶氨酸（-theanine，LTA）作為綠茶中一種非蛋白質(zhì)氨基酸成分，具有抗氧化、抗應(yīng)激、抗炎、抗腫瘤、降血壓、降脂、降低毒性和提高免疫力的作用[6-7]。LTA通過(guò)增加大鼠腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)分泌濃度和減少下丘腦-垂體-腎上腺軸上促腎上腺皮質(zhì)激素和皮質(zhì)醇的分泌而起到抗抑郁的作用[8]。有研究表明LTA可改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)促進(jìn)腸道對(duì)氨基酸的吸收[9]，增加腸道有益菌屬的比例，促進(jìn)短鏈脂肪酸（Short chain fatty acid，SCFA）的產(chǎn)生[10]。LTA對(duì)產(chǎn)腸毒性大腸桿菌引起的免疫應(yīng)激小鼠的肝臟和腸道具有保護(hù)作用[11-12]。此外，Lin等[13]研究表明，LTA可通過(guò)胰島素和磷酸腺苷（Adenosine monophosphate，AMP）激活的蛋白激酶信號(hào)通路，調(diào)節(jié)葡萄糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)代謝。然而目前國(guó)內(nèi)外尚未有關(guān)于LTA對(duì)PCOS大鼠干預(yù)效果的研究報(bào)道，本研究旨在探討LTA對(duì)來(lái)曲唑誘導(dǎo)的PCOS大鼠發(fā)情周期、體重、腹腔脂肪、血脂、血清性激素、血清脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、血清胰島素（Insulin，INS）及胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）和卵巢組織學(xué)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

來(lái)曲唑（L833525，純度大于98%），購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；羧甲基纖維素鈉（Carboxymethylcellulose sodium，CMC，純度大于99%），購(gòu)于西隴科學(xué)股份有限公司；-茶氨酸（T106216，純度大于98%），購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司?？偰懝檀迹═otal cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、低密度脂蛋白（Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白（High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、脂多糖測(cè)定試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所；胰島素、雌二醇（Estradiol，E2）、睪酮（Testosterone，T）、黃體生成素（Luteinizing hormone，LH）、卵泡刺激素（Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）ELISA試劑盒均購(gòu)于江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。普通嚙齒類維持飼料（AIN-93M），購(gòu)自常州鼠一鼠二生物科技有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

FA2004電子分析天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；Eppendorf 5424R型冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Scientific科技公司；Leica DM4B正置顯微鏡，德國(guó)Leica光學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

28只6周齡、體重(173.82±9.33)?g的健康雌性SD大鼠，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002]，飼養(yǎng)于桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物房[實(shí)驗(yàn)單位許可證號(hào)：SYXK（桂）2020-0005]。所有大鼠均在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境內(nèi)[室溫：(22±1)℃，相對(duì)濕度：60%，每日明暗周期：12?h/12?h]合籠飼養(yǎng)（每籠2～3只）。試驗(yàn)期間所有大鼠均飼喂AIN-93M標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由攝食及清潔飲水。本試驗(yàn)研究方案經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)審核（許可號(hào)：GLMC201806003）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 PCOS大鼠模型建立及LTA干預(yù)分組

所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，依隨機(jī)法將其分成正常對(duì)照組、PCOS模型組、PCOS＋低劑量LTA（PCOS＋LTA-L）組和PCOS＋高劑量LTA（PCOS＋LTA-H）組，每組7只。正常對(duì)照組在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中每日灌胃生理鹽水（1?mL·100?g-1·d-1）。

PCOS模型建立：參照Kafali等[14]的方法，除正常對(duì)照組持續(xù)灌胃生理鹽水外，其余組均28?d持續(xù)灌胃來(lái)曲唑（1?mg·kg-1·d-1）建立PCOS模型。隨后進(jìn)行30?d的干預(yù)試驗(yàn)。

干預(yù)方案如表1所示，正常對(duì)照組和PCOS模型組大鼠持續(xù)灌胃生理鹽水；低、高劑量LTA干預(yù)組大鼠在停止灌胃來(lái)曲唑的同時(shí)，分別持續(xù)灌胃50?mg·kg-1·d-1和200?mg·kg-1·d-1的LTA。LTA干預(yù)劑量的選擇參考宋玉欣等[15]和曾立等[16]的方法。在58?d的實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)，每3?d稱量大鼠體重，并維持大鼠自由攝食和清潔飲水。

1.4.2 大鼠發(fā)情周期檢測(cè)

雌性SD大鼠正常發(fā)情周期為4～5?d，從LTA干預(yù)第10天開(kāi)始，采集大鼠陰道脫落細(xì)胞涂片并進(jìn)行巴氏染色法連續(xù)觀察10?d陰道涂片以判斷大鼠發(fā)情周期規(guī)律變化，即：發(fā)情前期以扁平上皮細(xì)胞為主；發(fā)情期以角質(zhì)化細(xì)胞為主；發(fā)情期后期白細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞、扁平上皮細(xì)胞3種細(xì)胞比例相當(dāng)；發(fā)情間期以白細(xì)胞為主[17]。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理及取材方法

末次LTA干預(yù)后，大鼠禁食12?h但自由飲水。CO2麻醉處死大鼠后，取腹主動(dòng)脈血約5?mL，靜置0.5?h后，冷凍離心機(jī)4℃，1?200?r·min-1離心15?min，分離的血清用于各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。置冰上快速分離大鼠臟器和腎周、子宮及腹部等處脂肪組織，使用電子分析天平稱重并記錄質(zhì)量（腎周、子宮周及腹部脂肪質(zhì)量之和為腹腔脂肪質(zhì)量）。取一邊卵巢放入4%（體積分?jǐn)?shù)）多聚甲醛固定備用，其余取出的各個(gè)材料無(wú)菌包裝后均及時(shí)放置–80℃冰箱備用。

1.4.4 大鼠卵巢組織學(xué)形態(tài)觀察

取固定好的卵巢組織，由桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科進(jìn)行石蠟包埋并行H&E染色，中性樹(shù)脂封片后于顯微鏡下觀察各組大鼠卵巢組織學(xué)形態(tài)。

1.4.5 血脂相關(guān)指標(biāo)及血清LPS水平檢測(cè)

按照試劑盒說(shuō)明書操作要求檢測(cè)大鼠血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C、FPG及LPS水平。

1.4.6 激素相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

按照試劑盒說(shuō)明書操作要求檢測(cè)大鼠血清中E2、T、LH、FSH及INS水平，計(jì)算HOMA-IR公式如下：

HOMA-IR=（胰島素×空腹血糖）÷22.5

式中，胰島素和空腹單位分別為mU·L-1和mmol·L-1。

1.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 LTA干預(yù)對(duì)PCOS大鼠發(fā)情周期的影響

正常對(duì)照組大鼠以發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期、發(fā)情間期依次循環(huán)出現(xiàn)規(guī)律性的發(fā)情周期，而PCOS模型組發(fā)情周期呈不規(guī)律變化。PCOS＋LTA-L組和PCOS＋LTA-H組在干預(yù)過(guò)程中發(fā)情周期變化得到明顯改善（圖1）。其中，PCOS＋LTA-L組于第三天發(fā)情周期逐漸恢復(fù)正常，PCOS＋LTA-H組于第四天發(fā)情周期逐漸恢復(fù)正常。結(jié)果表明，LTA干預(yù)能使PCOS大鼠發(fā)情周期規(guī)律變化，低劑量和高劑量的LTA對(duì)PCOS引起的發(fā)情周期不規(guī)律均有明顯改善作用，且低劑量的LTA改善效果更好。

2.2 LTA干預(yù)對(duì)PCOS大鼠卵巢的影響

卵巢中出現(xiàn)多個(gè)擴(kuò)張性囊狀卵泡是PCOS的典型特征。如圖2所示，肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，PCOS模型組大鼠卵巢的表面比正常對(duì)照組粗糙蒼白，且卵巢體積較大。而不同LTA干預(yù)處理后的PCOS大鼠的卵巢表面比PCOS模型組紅潤(rùn)有光澤，且體積也較小。而各組大鼠卵巢標(biāo)本經(jīng)H&E染色后鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組大鼠卵巢中有多個(gè)黃體整齊排列，形態(tài)完整，顆粒細(xì)胞層較厚。而PCOS模型組大鼠卵巢中黃體體積較小且數(shù)目少，顆粒細(xì)胞層變薄，多見(jiàn)囊狀擴(kuò)張卵泡和閉鎖卵泡。與PCOS模型組相比，PCOS＋LTA-L組和PCOS＋LTA-H組大鼠卵巢黃體數(shù)目增多，少見(jiàn)囊性擴(kuò)張卵泡，顆粒細(xì)胞層較厚。以上結(jié)果表明，兩種劑量LTA均能有效改善PCOS大鼠的卵巢病變。

2.3 LTA干預(yù)對(duì)PCOS大鼠體重和腹腔脂肪相對(duì)質(zhì)量的影響

如表2所示，在體重方面，開(kāi)始造模前各組大鼠的體重之間相比均無(wú)顯著性差異（＞0.05）。而連續(xù)灌胃來(lái)曲唑建模后，PCOS模型組、PCOS＋LTA-L組和PCOS＋LTA-H組的體重均比正常對(duì)照組顯著升高（＜0.05），且PCOS模型組、PCOS＋LTA-L組和PCOS＋LTA-H組之間無(wú)顯著性差異（＞0.05）。經(jīng)LTA干預(yù)后，與PCOS模型組相比，PCOS＋LTA-L組和PCOS＋LTA-H組的體重均有所減輕，但無(wú)顯著性差異（＞0.05）。在腹腔脂肪方面，與正常對(duì)照組相比，PCOS模型組大鼠的腹腔脂肪相對(duì)質(zhì)量顯著上升了42.41%（＜0.05）。與PCOS模型組相比，PCOS＋LTA-L組和PCOS＋LTA-H組的腹腔脂肪相對(duì)質(zhì)量分別下降了29.75%和26.63%（＜0.05），但PCOS＋LTA-L組和PCOS＋LTA-H組之間并無(wú)顯著性差異（＞0.05）。以上結(jié)果表明，兩種劑量的LTA干預(yù)對(duì)PCOS大鼠體重均有一定程度的減輕作用，且顯著降低了PCOS大鼠的腹腔脂肪相對(duì)質(zhì)量。

注：S：扁平上皮細(xì)胞；K：角質(zhì)化細(xì)胞；L：白細(xì)胞

注：C：黃體；F：卵泡

表2 LTA對(duì)PCOS大鼠體重和腹腔脂肪相對(duì)質(zhì)量的影響

注：a：與正常組比較，<0.05；b：與PCOS組比較，<0.05；ns：表示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

Note: a: compared with the normal group,<0.05. b: compared with the PCOS group,<0.05. ns: indicates no statistical difference

2.4 LTA干預(yù)對(duì)PCOS大鼠血糖、血清胰島素水平及胰島素抵抗的影響

如圖3所示，與正常對(duì)照組相比，PCOS模型組FPG僅上升了4.66%（>0.05），而血清INS水平和HOMA-IR分別顯著上升了22.34%和20.58%（<0.05）。而與PCOS模型組相比，PCOS＋LTA-L組和PCOS＋LTA-H組FPG分別下降了4.97%和2.03%（>0.05），血清INS水平下降了26.89%和22.49%（<0.05），HOMA-IR下降了23.37%和19.45%（<0.05），但PCOS＋LTA-L組和PCOS＋LTA-H組之間的FPG、血清INS和HOMA-IR均無(wú)顯著性差異（>0.05）。結(jié)果提示兩種劑量的LTA均能顯著降低了PCOS大鼠的血清INS水平，改善大鼠IR程度。

2.5 LTA干預(yù)對(duì)PCOS大鼠血清性激素水平的影響

如圖4所示，較正常對(duì)照組大鼠而言，PCOS模型組大鼠血清T和LH水平以及LH/FSH分別升高了19.37%、20.44%和41.35%（<0.05），E2和FSH水平分別顯著降低了28.56%和29.24%（<0.05）。而與PCOS模型組相比，PCOS＋LTA-L組和PCOS＋LTA-H組大鼠血清T水平均分別下降了16.08%和21.14%（<0.05），血清LH水平降低了21.88%和25.74%（<0.05），血清LH/FSH雖分別下降了9.24%和9.65%但兩者間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05）。在E2水平方面，PCOS＋LTA-L組升高了24.38%（<0.05），而PCOS＋LTA-H組升高了9.80%（>0.05）。在FSH水平方面，PCOS＋LTA-L組升高了10.32%（>0.05），而PCOS＋LTA-H組升高了19.78%（<0.05）。以上結(jié)果表明，兩種劑量的LTA能夠顯著調(diào)節(jié)PCOS大鼠體內(nèi)性激素的分泌水平，且高劑量的改善效果要優(yōu)于低劑量LTA。

2.6 LTA干預(yù)對(duì)PCOS大鼠血脂及LPS水平的影響

如圖5所示，在血脂方面，與正常對(duì)照組相比，PCOS組大鼠血清TG、TC和LDL-C水平顯著升高了25.98%、68.46%和72.14%（<0.05），而血清HDL-C水平則降低了33.58%（<0.05）。與PCOS模型組大鼠相比，PCOS＋LTA-L組和PCOS＋LTA-H組大鼠血清TG水平分別降低了20.88%和21.38%（<0.05），血清TC水平分別降低了30.95%和40.39%（<0.05），血清LDL-C水平分別降低了34.01%和31.44%（<0.05），血清HDL-C水平分別升高了37.30%和50.46%（<0.05）。PCOS＋LTA-L組和PCOS＋LTA-H組之間對(duì)PCOS大鼠血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C和LPS的作用差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05）。在LPS方面，與正常對(duì)照組相比，PCOS組大鼠血清LPS水平升高了66.90%（<0.05）。而與PCOS模型組大鼠相比，PCOS＋LTA-L組和PCOS＋LTA-H組大鼠血清LPS水平降低了58.42%和70.16%（<0.05）。上述結(jié)果顯示，兩種劑量的LTA均能顯著改善PCOS大鼠的血脂紊亂及升高的LPS水平。

注：a：與正常組比較，P<0.05；b：與PCOS組比較，P<0.05

注：a：與正常組比較，<0.05；b：與PCOS組比較，<0.05

Note: a: compared with the normal group,<0.05. b: compared with the PCOS group,<0.05

注：a：與正常組比較，P<0.05；b：與PCOS組比較，P<0.05

3 討論與結(jié)論

PCOS作為一種青春期及育齡期婦女常見(jiàn)的代謝紊亂性生殖內(nèi)分泌疾病，不僅影響女性的生殖功能，同時(shí)伴有胰島素抵抗、高脂血癥等代謝疾病。因而對(duì)PCOS患者的治療，需要從不同途徑作用于PCOS患者的內(nèi)分泌異常和代謝紊亂，使其得到改善。LTA作為一種存在于茶樹(shù)中的非蛋白質(zhì)氨基酸，在抗氧化、抗應(yīng)激、抗炎、調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)、糾正代謝紊亂上均有一定的功效。本試驗(yàn)使用不同劑量的LTA干預(yù)來(lái)曲唑誘導(dǎo)的PCOS大鼠，分析其干預(yù)效果及機(jī)制。

本研究通過(guò)對(duì)大鼠灌胃來(lái)曲唑構(gòu)造PCOS大鼠模型。來(lái)曲唑是一種非甾體芳香酶抑制劑，幾乎不溶于水，而CMC作為一種理想的食品添加劑，也常添加于飼料中作為粘合劑，在一定劑量范圍內(nèi)對(duì)大鼠無(wú)特殊影響，故選用性質(zhì)穩(wěn)定低濃度的1%CMC充當(dāng)懸浮劑[18]。干預(yù)結(jié)束后，H&E染色結(jié)果顯示PCOS組大鼠卵巢出現(xiàn)了病理?yè)p傷，表現(xiàn)為顆粒細(xì)胞層變薄，囊狀擴(kuò)張卵泡和閉鎖卵泡增多，而PCOS組大鼠的發(fā)情周期未恢復(fù)正常，提示PCOS大鼠模型建造成功。同時(shí)本研究結(jié)果表明兩種劑量LTA均能有效改善PCOS大鼠卵巢的病理?yè)p傷。

PCOS患者中肥胖或超重的發(fā)生率約為40%～70%[19]，腹腔脂肪的過(guò)度堆積則會(huì)增加患者發(fā)生代謝綜合征的風(fēng)險(xiǎn)[20]，其中以糖脂代謝紊亂最為顯著。本研究的數(shù)據(jù)顯示，PCOS模型組大鼠體重及腹部脂肪相對(duì)質(zhì)量顯著上升。說(shuō)明PCOS也同樣能導(dǎo)致大鼠體重增加以及腹部脂肪堆積。經(jīng)過(guò)LTA干預(yù)之后，PCOS大鼠體重增長(zhǎng)均受到抑制，且腹腔脂肪相對(duì)質(zhì)量顯著降低。虞希沖等[21]研究發(fā)現(xiàn)，茶氨酸能抑制雌性小鼠體重增長(zhǎng)，所得的結(jié)論與本研究類似。研究表明，LTA可能通過(guò)影響PPAR/CPT-1、PPARα/LXRα及SREBP-1c/ACC1通路，進(jìn)而促進(jìn)大鼠脂肪酸氧化并抑制脂肪積累[22]，最終減少大鼠腹腔脂肪的堆積并抑制大鼠體重的增長(zhǎng)。

糖代謝異常是PCOS最為顯著的代謝紊亂之一，而糖代謝異常的根本原因是IR的發(fā)生，也是PCOS重要的臨床特征之一。IR使機(jī)體組織對(duì)INS的敏感性下降，導(dǎo)致胰島細(xì)胞代償性分泌更多INS以維持正常葡萄糖水平，進(jìn)一步加重IR[23]。本研究結(jié)果顯示，PCOS模型組大鼠的INS水平均顯著上升，F(xiàn)PG水平未顯著升高，這符合IR的表現(xiàn)。HOMA-IR是衡量胰島素抵抗的指標(biāo)。一項(xiàng)人群調(diào)查研究[24]顯示，PCOS患者的INS和HOMA-IR水平均顯著高于與其年齡和BMI匹配的正常對(duì)照組。本研究發(fā)現(xiàn)，PCOS＋LTA-L組和PCOS＋LTA-H組大鼠的INS水平和HOMA-IR均顯著降低，說(shuō)明LTA可改善PCOS大鼠的糖代謝紊亂。一項(xiàng)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[25]發(fā)現(xiàn)，LH在使卵泡膜細(xì)胞產(chǎn)生雄激素的同時(shí)，還激活了INS生長(zhǎng)因子（Insulin growth factor，IGF），促進(jìn)INS分泌。林玲[22]的研究也指出，LTA對(duì)大鼠IGF1及其受體的表達(dá)有抑制作用，能夠通過(guò)促進(jìn)胰島素與胰島素受體結(jié)合從而激活了胰島素通路。以上的研究提示LTA可能通過(guò)抑制大鼠IGF1及其受體的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)了PCOS大鼠組織對(duì)胰島素的敏感性，并減少了PCOS大鼠胰島素的分泌，最終改善機(jī)體IR情況。

除了糖代謝，血脂代謝異常也是PCOS患者中另一個(gè)常見(jiàn)代謝異常途徑，其主要表現(xiàn)為TG、TC、LDL-C升高和HDL-C降低[26]。血脂代謝異常的發(fā)生發(fā)展與HA和IR關(guān)系密切，其可能機(jī)制是由于PCOS患者體內(nèi)的高雄激素環(huán)境能夠使機(jī)體循環(huán)中非酯化脂肪酸釋放增加，而非酯化脂肪酸在肝臟內(nèi)合成TG和TC增多，使得血清中的TG和TC升高。此外，高雄激素環(huán)境還通過(guò)增強(qiáng)脂肪細(xì)胞中的腎上腺素能受體和腺苷酸環(huán)化酶在脂代謝中的作用降低血清中HDL水平。同時(shí)，IR也能使肝臟內(nèi)非酯化脂肪酸堆積，導(dǎo)致LDL和TG合成增加[27]。此外，有研究證實(shí)PCOS與腸道菌群紊亂具有密切聯(lián)系。與正常女性組相比，PCOS患者組糞便中有益菌屬、、和豐度顯著降低，而擬桿菌屬及埃希菌屬等部分革蘭陰性菌豐度顯著增加[28-29]。而腸道中革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要組分LPS，可穿過(guò)腸壁進(jìn)入血循環(huán)后，引起全身持續(xù)性低水平炎性反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體血脂代謝紊亂[30]。研究結(jié)果顯示，LTA干預(yù)使PCOS大鼠血清中TG、TC、LDL-C水平顯著降低，HDL-C水平顯著升高。同時(shí)，我們檢測(cè)并分析了PCOS＋LTA-L組和PCOS＋LTA-H組大鼠血清中T、INS以及LPS水平，結(jié)果顯示T、INS、LPS水平均顯著低于PCOS模型組大鼠（<0.05）。說(shuō)明LTA通過(guò)改善HA和IR進(jìn)一步影響了大鼠血脂代謝；同時(shí)降低血清中LPS水平，使腸道菌群的結(jié)構(gòu)得到改善，最終達(dá)到調(diào)節(jié)血脂紊亂的作用。此外，Xu等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，LTA可增加大鼠糞便中，和等產(chǎn)SCFA菌屬的比例，從而增加了腸道中SCFA的總量，而SCFA可以增強(qiáng)IL-22的產(chǎn)生，保護(hù)腸道免受炎癥的侵害[31]。這提示LTA也可能通過(guò)調(diào)節(jié)SCFA改善血脂代謝紊亂，后續(xù)可做進(jìn)一步研究。

性激素紊亂是PCOS的主要癥狀和關(guān)鍵診斷特征。性激素分泌紊亂使PCOS大鼠發(fā)情周期呈不規(guī)律變化，而長(zhǎng)期性激素分泌失調(diào)可導(dǎo)致卵巢中出現(xiàn)多個(gè)擴(kuò)張性囊狀卵泡和閉鎖卵泡等PCOS典型特征改變。有研究報(bào)道，雌性小鼠長(zhǎng)期處于雄激素過(guò)多的狀態(tài)，會(huì)導(dǎo)致卵泡發(fā)育異常，即使恢復(fù)到正常的雄激素水平，正常卵泡發(fā)育軌跡仍受到干擾[32]。正常情況下，LH和卵泡膜細(xì)胞上的LH受體結(jié)合產(chǎn)生T及雄烯二酮為主的雄激素，T可芳香化后轉(zhuǎn)化為E2，而PCOS患者的LH分泌過(guò)多引起顆粒細(xì)胞的過(guò)早黃體化，不利于卵泡生長(zhǎng)和排卵，雄激素水平也隨之增高。此外，PCOS患者的FSH分泌被抑制，由FSH介導(dǎo)的芳香化酶也受到抑制，使得E2水平下降而T水平持續(xù)升高，性激素水平紊亂形成惡性循環(huán)，從而加速HA的發(fā)展[33-34]。研究結(jié)果顯示，PCOS＋LTA-L組和PCOS＋LTA-H組大鼠性激素水平較PCOS組均有顯著改善。陰道涂片一般用于觀察大鼠的發(fā)情周期情況。結(jié)果顯示，PCOS＋LTA-L組和PCOS＋LTA-H組大鼠的發(fā)情周期均恢復(fù)正常。相比于PCOS＋LTA-L組，PCOS＋LTA-H組大鼠的發(fā)情周期恢復(fù)時(shí)間較長(zhǎng)，而本研究結(jié)果中LH/FSH比值與此結(jié)果趨勢(shì)一致，提示LH和FSH可能是影響PCOS大鼠發(fā)情周期的主要指標(biāo)。此外，有研究也發(fā)現(xiàn)高水平的雄激素與胰島素抵抗之間存在雙向關(guān)系，當(dāng)機(jī)體處于高胰島素環(huán)境下時(shí)，PCOS患者體內(nèi)肝性激素結(jié)合球蛋白的產(chǎn)生水平也較正常人群升高，且同時(shí)也增加了游離睪丸激素的分泌量[35]。而較高的胰島素水平會(huì)刺激卵泡膜細(xì)胞的雄激素合成，同時(shí)胰島素抵抗會(huì)上調(diào)黃體生成素的分泌水平[27,36]。因此，LTA改善PCOS大鼠性激素水平紊亂的機(jī)制可能與其降低了胰島素抵抗水平有一定的關(guān)系。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示LTA處理可抑制PCOS大鼠體重的增長(zhǎng)，改善IR、脂代謝紊亂并有效調(diào)控性激素和LPS的異常分泌，使PCOS大鼠卵巢多囊性病變得到改善及發(fā)情周期正?；@為L(zhǎng)TA應(yīng)用于PCOS的輔助治療和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供了一定的科學(xué)依據(jù)。但是LTA對(duì)PCOS大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)及腸道菌群結(jié)構(gòu)的具體影響尚不明確，后續(xù)應(yīng)針對(duì)氧化應(yīng)激水平及腸道菌群分布展開(kāi)研究，以便探明其具體作用機(jī)制。

[1] Rao P, Bhide P. Controversies in the diagnosis of polycystic ovary syndrome [J]. Therapeutic Advances in Reproductive Health, 2020, 14: 1-11. doi: 10.1177/2633494120913032.

[2] Yang R, Yang S, Li R, et al. Effects of hyperandrogenism on metabolic abnormalities in patients with polycystic ovary syndrome: a meta-analysis [J]. Reprod Biol Endocrinol, 2016, 14(1): 67. doi: 10.1186/s12958-016-0203-8.

[3] Liu Q, Xie Y J, Qu L H, et al. Dyslipidemia involvement in the development of polycystic ovary syndrome [J]. Taiwanese Journal of Obstetrics & Gynecology, 2019, 58(4): 447-453.

[4] Jin P P, Xie Y Y. Treatment strategies for women with polycystic ovary syndrome [J]. Gynecol Endocrinol, 2018, 34(4): 272-277.

[5] Cunha A, Póvoa A M. Infertility management in women with polycystic ovary syndrome: a review [J]. Porto Biomed Journal, 2021, 6(1): e116. doi: 10.1097/j.pbj.0000000000000116.

[6] 劉杉, 李煒. L-茶氨酸藥理作用的研究進(jìn)展[J]. 神經(jīng)藥理學(xué)報(bào), 2020, 10(2): 24-32.

Liu S, Li W. Research progress on pharmacological effects of L-theanine [J]. Acta Neuropharmacologica, 2020, 10(2): 24-32.

[7] 楊洲. 茶氨酸保健作用研究進(jìn)展[J]. 茶葉通訊, 2018, 45(2): 3-7. Yang Z. Research progress in the healthy functions of theanine [J]. Journal of Tea Communication, 2018, 45(2): 3-7.

[8] 彭彬, 劉仲華, 林勇, 等.-茶氨酸改善慢性應(yīng)激大鼠抑郁行為作用研究[J]. 茶葉科學(xué), 2014, 34(4): 355-363.

Peng B, Liu Z H, Lin Y, et al. The ameliorative effect of-theanine on chronic unpredictable mild stress-induced depression in rats [J]. Journal of Tea Science, 2014, 34 (4): 355-363.

[9] 彭影琦, 肖文軍, 張盛, 等.-茶氨酸對(duì)小鼠腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)及游離氨基酸的影響[J]. 茶葉科學(xué), 2019, 39(1): 43-54.

Peng Y Q, Xiao W J, Zhang S, et al. Effects of-theanine on intestinal morphology and free amino acids in mice [J]. Journal of Tea Science, 2019, 39(1): 43-54.

[10] Xu W, Lin L, Liu A, et al. L-theanine affects intestinal mucosal immunity by regulating short-chain fatty acid metabolism under dietary fiber feeding [J]. Food & Function, 2020, 11(9): 8369-8379.

[11] 劉秋玲, 龔志華, 陳凌, 等.-茶氨酸對(duì)產(chǎn)腸毒性大腸桿菌引起的免疫應(yīng)激小鼠肝臟的保護(hù)作用研究[J]. 茶葉科學(xué), 2016, 36(5): 484-490.

Liu Q L, Gong Z H, Chen L, et al. Study on the protective effect of-theanine on the liver of mice with immune stress induced by ETEC [J]. Journal of Tea Science, 2016, 36(5): 484-490.

[12] 劉遵瑩, 劉秋玲, 鄧燕莉, 等.-茶氨酸對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌引起的免疫應(yīng)激小鼠腸道的保護(hù)作用研究[J]. 茶葉科學(xué), 2016, 36(5): 469-476.

Liu Z Y, Liu Q L, Deng Y L, et al. Study on the protective effect of-Theanine on the intestinal in mice with immune stress induced by ETEC [J]. Journal of Tea Science, 2016, 36(5): 469-476.

[13] Lin L, Zeng L, Liu A, et al. L-Theanine regulates glucose, lipid, and protein metabolisminsulin and AMP-activated protein kinase signaling pathways [J]. Food & Function, 2020, 11(2): 1798-1809.

[14] Kafali H, Iriadam M, Ozardali I, et al. Letrozole-induced polycystic ovaries in the rat: a new model for cystic ovarian disease [J]. Archives of Medical Research, 2004, 35(2): 103-108.

[15] 宋玉欣, 張嬌, 賀麟, 等.-茶氨酸對(duì)高蛋白飲食誘導(dǎo)大鼠行為變化的干預(yù)作用[J]. 食品科學(xué), 2021, 42(5): 187-192.

Song Y X, Zhang J, He L, et al. Intervention effect of L-theanine on behavioral changes induced by high protein diet in rats [J]. Food Science, 2021, 42(5): 187-192.

[16] 曾立, 林玲, 彭影琦, 等.-茶氨酸對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)衰老大鼠肝臟的晚期糖基化終末產(chǎn)物和炎性介質(zhì)的影響[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2019, 45(6): 641-649.

Zeng L, Lin L, Peng Y Q, et al. Effect of-theanine on AGEs and inflammatory mediators in the liver of-galactose-induced senescence rats [J]. Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences), 2019, 45(6): 641-649.

[17] 閆麗, 溫和, 唐桂毅, 等. 大鼠陰道細(xì)胞涂片不同染色方法在動(dòng)情周期判定中的價(jià)值[J]. 藥物評(píng)價(jià)研究, 2020, 43(1): 72-76.

Yan L, Wen H, Tang G Y, et al. Diagnostic value of three staining methods for rat vaginal cell smears in determination of estrous cycle [J]. Drug Evaluation Research, 2020, 43(1): 72-76.

[18] 楊金姝. 羧甲基纖維素鈉在食品工業(yè)中的應(yīng)用研究[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工, 2014(11): 76-78.

Yang J S. Application of sodium carboxymethyl cellulose in food industry [J]. Farm Products Processing, 2014(11): 76-78.

[19] Beydoun H A, Beydoun M A, Hossain S, et al. Patterns of bariatric surgeries among US women diagnosed with polycystic ovarian syndrome [J]. Journal of Women's Health, 2020, 29(4): 585-595.

[20] Dumesic D A, Akopians A L, Madrigal V K, et al. Hyperandrogenism accompanies increased Intra-abdominal fat storage in normal weight polycystic ovary syndrome women [J]. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2016, 101(11): 4178-4188.

[21] 虞希沖, 楊偉, 吳波拉. 茶氨酸經(jīng)下丘腦腹外側(cè)核抑制雌性小鼠攝食與胃排空作用研究[J]. 茶葉科學(xué), 2013, 33(5): 429-435.

Yu X C, Yang W, Wu B L. Theanine depressed the food intake and gastric emptying in female mice via lateral hypothalamic AMPA and NMDA receptor [J]. Journal of Tea Science, 2013, 33(5): 429-435.

[22] 林玲. L-茶氨酸對(duì)糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝的影響及機(jī)制[D]. 長(zhǎng)沙: 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2019.

Lin L. Effects and mechanisms of L-theanine on metabolism of glucose, lipid and protein [D]. Changsha: Hunan Agricultural University, 2019.

[23] 胡偉. PCOS患者糖脂代謝異常及其與胰島素抵抗的相關(guān)性分析[D]. 新鄉(xiāng): 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院, 2017.

Hu W. Abnormal glucose and lipid metabolism in PCOS patients and its correlation with insulin resistance [D]. Xinxiang : Xinxiang Medical College, 2017.

[24] Alissa E M, Algarni S A, Khaffji A J, et al. Role of inflammatory markers in polycystic ovaries syndrome: in relation to insulin resistance [J]. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research, 2021, 47(4):1409-1415.

[25] Hattori K, Orisaka M, Fukuda S, et al. Luteinizing hormone facilitates antral follicular maturation and survival via thecal paracrine signaling in cattle [J]. Endocrinology, 2018, 159(6): 2337-2347.

[26] Gourgari E, Lodish M, Shamburek R, et al. Lipoprotein particles in adolescents and young women with PCOS provide insights into their cardiovascular risk [J]. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2015, 100(11): 4291-4298.

[27] 張美微, 侯麗輝, 李妍. 高雄激素血癥與胰島素抵抗對(duì)PCOS患者脂代謝的影響[J]. 河北醫(yī)學(xué), 2019, 25(10): 1690-1694.

Zhang M W, Hou L H, Li Y. Effects of hyperandrogenemia and insulin resistance on lipid metabolism in patients with PCOS [J]. Hebei Medicine, 2019, 25(10): 1690-1694.

[28] Liu R, Zhang C, Shi Y, et al. Dysbiosis of gut microbiota associated with clinical parameters in polycystic ovary syndrome [J]. Frontiers in Microbiology, 2017, 8: 324. doi: 10.3389/fmicb.2017.00324.

[29] Zhang J, Sun Z, Jiang S, et al. Probiotic bifidobacterium lactis V9regulates the secretion of sex hormones in polycystic ovary syndrome patients through the gut-brain Axis [J]. mSystems, 2019, 4(2): e00017- e00019. doi: 10.1128/mSystems.00017-19.

[30] Hersoug L G, M?ller P, Loft S. Gut microbiota-derived lipopolysaccharide uptake and trafficking to adipose tissue: implications for inflammation and obesity [J]. Obesity Reviews, 2016, 17(4): 297-312.

[31] Yang W, Yu T, Huang X, et al. Intestinal microbiota-derived short-chain fatty acids regulation of immune cell IL-22 production and gut immunity [J]. Nature Communications, 2020, 11(1): 4457. doi: 10.1038/s41467-020-18262-6.

[32] Bertoldo M J, Caldwell A S L, Riepsamen A H, et al. A Hyperandrogenic environment causes Intrinsic defects that are detrimental to follicular dynamics in a PCOS mouse model [J]. Endocrinology, 2019, 160(3): 699-715.

[33] Dumesic D A, Oberfield S E, Stener-Victorin E, et al. Scientific statement on the diagnostic criteria, epidemiology, pathophysiology, and molecular genetics of polycystic ovary syndrome [J]. Endocrine Reviews, 2015, 36(5): 487-525.

[34] Dewailly D, Robin G, Peigne M, et al. Interactions between androgens, FSH, anti-Müllerian hormone and estradiol during folliculogenesis in the human normal and polycystic ovary [J]. Human Reproduction Update, 2016, 22(6): 709-724.

[35] Cassar S, Misso M L, Hopkins W G, et al. Insulin resistance in polycystic ovary syndrome: a systematic review and meta-analysis of euglycaemic-hyperinsulinaemic clamp studies [J]. Human Reproduction, 2016, 31(11): 2619-2631.

[36] Moghetti P, Tosi F. Insulin resistance and PCOS: chicken or egg? [J]. Journal of Endocrinological Investigation, 2021, 44(2): 233-244.

-Theanine Ameliorated Clinical Symptoms in Letrozole-Induced Polycystic Ovary Syndrome Rats

HUANG Qiuping1, XIE Chenyang1, LI Xinyu1, JIN Bin1, ZENG Zhen1,2, QIAN Bo1,3, DAI Ling6*, SONG Jiale1,4,5,7*

1. School of Public Health, Guilin Medical University, Guilin 541199, China; 2. Xiangya School of Public Health, Central South University, Changsha 410000, Hunan; 3. School of Public Health, Xiamen University, Xiamen 361102, China; 4.Guangxi Health Commission Key Laboratory of Entire Lifecycle Health and Care, Guilin 541199, China; 5. Guangxi Key Laboratory of Enviromental Exposomics and Entire Lifecycle Health, Guilin 541199, China; 6. Center of Mental Health Education and Counseling, Guilin Medical University, Guilin 541199, China; 7. Department of Clinical Nutrition, The Second Affiliated Hospital of Guilin Medical College, Guilin 541109, China

To explore the improvement effect of-theanine (LTA) on the clinical symptoms of letrozole-induced polycystic ovary syndrome (PCOS) rats, twenty-eight female SD rats were randomly divided into control group, PCOS group, PCOS+low-dose LTA group, and PCOS+high-dose LTA group with 7 rats in each group. In the modeling stage, except for the control group, the other three groups were administered letrozole continuously for 28 days to induce the PCOS model. During the intervention phase, the normal control group and the PCOS group were given continuous gastric administration with normal saline, and the rats in the two LTA groups were given continuous gastric administration with the corresponding dose of LTA intervention for 30 days. The results show that compared with the PCOS group, the serum testosterone (T), luteinizing hormone (LH), insulin (INS), triglyceride (TG), total cholesterol (TC), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), lipopolysaccharide (LPS) levels and homeostasis model assessment-insulin resistance (HOMA-IR) index in the LTA intervention group were significantly reduced (<0.05), high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) was significantly increased (<0.05), ratio of luteinizing hormone to follicle stimulating hormone (LH/FSH), fasting plasma glucose (FPG) and body weight were decreased (>0.05). The serum estradiol (E2) of rats in the low-dose LTA intervention group was significantly increased (<0.05). Follicle stimulating hormone (FSH) of mice in the high-dose LTA intervention group was significantly increased (<0.05). At the same time, rat estrous cycle disorder and polycystic lesions of ovarian tissue were improved to a certain extent compared with PCOS group. The results show that LTA intervention can effectively regulate the secretion of sex hormones in PCOS rats, restore the regular changes of the estrus cycle, improve their ovarian polycystic lesions, and significantly improve insulin resistance (IR) and blood lipid metabolism disorders in PCOS rats and inhibit abnormal levels of lipopolysaccharide (LPS) secretion.

-theanine, polycystic ovary syndrome, hyperandrogenemia, insulin resistance

S571.1；R373

A

1000-369X(2021)06-831-12

2021-03-25

2021-06-22

人社部“高層次留學(xué)人才回國(guó)資助計(jì)劃”（人社廳函[2019]160號(hào)）、廣西高等學(xué)校千名中青年骨干教師培育計(jì)劃資助（桂教人[2018]18號(hào)）、廣西高校中青年教師科研基礎(chǔ)能力提升項(xiàng)目（2018KY0401）、桂林醫(yī)學(xué)院引進(jìn)人才科研啟動(dòng)基金（04010150001）、2020年國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（202010601031）

黃秋萍，女，本科，主要從事?tīng)I(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)方面的研究。*通信作者：305743680@qq.com；songjiale@glmc.edu.cn

（責(zé)任編輯：趙鋒）