王 佩， 李一丹， 楊艷敏， 董 照， 原現(xiàn)華

邢臺醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院 血液內(nèi)科，河北 邢臺 054001

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種漿細(xì)胞過度增殖導(dǎo)致的血液系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。目前，硼替佐米(bortezomib，BTZ)是我國治療MM的一線化療藥物，而患者產(chǎn)生耐藥性是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和BTZ治療失敗的主要原因[2]。DNA損傷修復(fù)是參與保護(hù)MM細(xì)胞免受化療藥物遺傳毒性作用的主要途徑之一，其中，同源重組(homologous recombination，HR)與BTZ耐藥機制密切相關(guān)[3]。BTZ是一種基于硼酸的可逆蛋白酶體抑制劑，可顯著降低MM細(xì)胞中HR相關(guān)蛋白Rad51的表達(dá)水平，具有抗DNA修復(fù)的功能[4-5]。有研究報道，微小RNA(microRNA，miRNA)在介導(dǎo)抗癌藥物耐藥性中發(fā)揮重要作用，其中，miR-520g、miR-520h通過抑制人脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1，APE1)表達(dá)，影響下游分子Rad51轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致HR失調(diào)[6]。本研究旨在探討血清miR-520g、miR-520h水平對BTZ初治MM患者早期治療反應(yīng)性的影響及用于預(yù)測BTZ初治MM患者早期治療反應(yīng)性的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取自2016年1月至2020年7月收治的122例初診為MM的患者設(shè)為MM組，同時，選取50例健康志愿者設(shè)為健康組。MM患者均接受BTZ為基礎(chǔ)的一線治療方案，并根據(jù)患者早期治療反應(yīng)性進(jìn)行分組，其中，完全緩解、非常好的部分緩解、部分緩解為敏感組(n=78)，疾病穩(wěn)定、疾病進(jìn)展為難治組(n=44)。早期治療反應(yīng)和復(fù)發(fā)/進(jìn)展事件是根據(jù)國際骨髓瘤工作組(International Myeloma Working Group，IMWG)進(jìn)行定義[7]。MM患者納入標(biāo)準(zhǔn)：MM診斷符合《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南(2020版)》[8]診斷標(biāo)準(zhǔn)；入組前未接受過其他抗腫瘤治療。健康組納入標(biāo)準(zhǔn)：無惡性腫瘤病史；肝腎功能正常；性別構(gòu)成和年齡分布與MM組患者相匹配。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有系統(tǒng)性疾病、精神性疾?。凰幬镞^敏；腎功能不全；高鈣血癥；漿細(xì)胞白血??；急性心肌梗死病史或心肌缺血；合并其他惡性腫瘤；自身免疫缺陷。健康組男性31例，女性19例；年齡(52.46±15.70)歲。MM組男性72例，女性50例；年齡(51.83±15.47)歲。兩組年齡、性別構(gòu)成比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 治療方法 MM患者均接受以BTZ(西安楊森制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：J20160071)為基礎(chǔ)的方案，包括BD方案(硼替佐米、地塞米松)、VCD方案(硼替佐米、地塞米松、環(huán)磷酰胺)、VDT方案(硼替佐米、地塞米松、沙利度胺)。分別于每個療程第1、4、8、11天給予BTZ皮下注射，給藥量為1.0～1.3 mg/m2，治療4周為1個療程。65歲以上老年患者每周皮下注射BTZ治療1次，治療4周為1個療程?；颊咧委煏r間1～5個療程，中位治療時間為4個療程。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測方法 收集MM患者年齡、性別、治療方案、治療周期、血紅蛋白、蛋白、血肌酐、國際分期系統(tǒng)分期及染色體17P缺失情況等臨床資料。健康組在體檢時采集靜脈血樣本；MM患者在接受以BTZ為基礎(chǔ)的治療方案前，采集靜脈血樣本。靜脈血樣本置于血清分離管中，2 400 r/min離心處理10 min，血清樣本保存在-80℃?zhèn)溆谩Ｈ⊙鍢颖?，利用miRNeasy血清/血漿試劑盒(美國Qiagen公司)提取血清總RNA，加入3.5 μl的Cel-miR-39(美國Qiagen公司)作為內(nèi)參。取2 μl的RNA樣本用poly(A)聚合酶加尾，而后用oligo-dT引物逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，多聚腺苷酸化和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在同一管中平行進(jìn)行。42℃下進(jìn)行60 min逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，而后在95℃下滅活5 min。miRCURY LNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Qiagen公司。應(yīng)用miRCURY LNA miRNome Human PCR PanelⅠ、Ⅱ試劑盒(美國Qiagen公司)配制20 μl反應(yīng)體系(3 μl cDNA模板)，進(jìn)行實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，95℃ 2 min，45個擴增周期(95℃ 10 s，58.5℃ 30 s，72℃ 30 s)。每個周期后測量熒光曲線。用2-ΔΔCt法測定miRNA的相對表達(dá)量。引物序列：miR-520g正向引物序列5′-TCCCATGCTGTGACCCTCTA-3′、反向引物序列5′-CGGTAACACTCTAAAGGGAAGC-3′；miR-520h正向引物序列為5′-TCCCATGCTGTGACCCTCTA-3′、反向引物序列5′-ACAGTAACTCTAAAGGGAAGACT-3′。將miR-520g、miR-520h相關(guān)基因表達(dá)值歸一化為Cel-miR-39，并采用2-△△CT方法計算其表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 健康組與MM組血清miR-520g、miR-520h表達(dá)水平比較 MM組血清miR-520g、miR-520h表達(dá)水平低于健康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 健康組與MM組血清miR-520g、miR-520h水平比較

2.2 影響B(tài)TZ初治MM患者早期治療反應(yīng)性因素的單因素分析 敏感組與難治組患者年齡、染色體17P缺失發(fā)生率、修訂的國際分期系統(tǒng)分期及血清miR-520g、miR-520h表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 影響B(tài)TZ初治MM患者早期治療反應(yīng)性的單因素分析/例(百分率/%)

2.3 影響B(tài)TZ初治MM患者早期治療反應(yīng)性因素的多因素分析 對單因素分析有差異的變量進(jìn)行賦值，包括年齡(中位值為51歲，年齡≤51歲=0，年齡>51歲=1)、國際分期系統(tǒng)分期(Ⅰ期=0，Ⅱ期=1，Ⅲ期=2)、染色體17P缺失(否=0，是=1)、血清miR-520g(中位值0.765，miR-520g≤0.765=0，miR-520g>0.765=1)、血清miR-520h(中位值0.685，miR-520h≤0.685=0，miR-520h>0.685=1)。多因素Logistic回歸模型分析結(jié)果顯示，血清miR-520g>0.765、miR-520h>0.685是影響MM患者BTZ治療早期反應(yīng)性的獨立保護(hù)因素(P<0.05)。見表3。

表3 多因素Logistic回歸分析影響MM患者BTZ早期治療反應(yīng)的臨床因素

2.4 血清miR-520g、miR-520h水平對于BTZ初治MM早期反應(yīng)性的預(yù)測價值 血清miR-520g、miR-520h聯(lián)合預(yù)測BTZ初治MM早期反應(yīng)性的AUC高于血清miR-520g、miR-520h單獨預(yù)測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=3.463、2.778，P<0.05)。見表4、圖1。

圖1 血清miR-520g、miR-520h預(yù)測BTZ初治MM早期反應(yīng)性的ROC曲線

表4 血清miR-520g、miR-520h水平對BTZ初治MM早期反應(yīng)性的預(yù)測價

3 討論

MM是漿細(xì)胞惡性腫瘤，在骨髓中積聚，導(dǎo)致骨破壞和骨髓衰竭[9]。MM是僅次于非霍奇金淋巴瘤的第二大常見血液系統(tǒng)惡性腫瘤[10]。BTZ是一種基于硼酸的可逆蛋白酶體抑制劑，參與細(xì)胞蛋白穩(wěn)態(tài)的泛素-蛋白酶體途徑[11-12]。有研究報道，用BTZ處理MM細(xì)胞可顯著降低HR相關(guān)蛋白Rad51的蛋白表達(dá)水平，說明BTZ的細(xì)胞毒作用與抗DNA修復(fù)功能有關(guān)[13]。BTZ可通過特異性結(jié)合蛋白酶活化位點，抑制泛素-蛋白酶體途徑及核因子κB抑制因子的降解，并可抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤、骨髓瘤體的血液供應(yīng)，在未治療和復(fù)發(fā)/難治性MM患者中發(fā)揮了重要的抗骨髓瘤活性[14]。BTZ被證實可提高M(jìn)M患者的緩解率，增加緩解深度并延長MM患者的存活期[15]。然而，BTZ原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥仍不可避免，僅40%的患者對BTZ單藥治療有反應(yīng)，且隨著治療的推進(jìn)，多數(shù)患者產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥[16]。為避免醫(yī)療資源浪費，推動精準(zhǔn)醫(yī)療發(fā)展，早期預(yù)測BTZ的治療反應(yīng)性及患者預(yù)后十分重要。

miRNA是非編碼小分子RNA，在多種人類基因(包括癌基因和抑癌基因)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用[17]。近年來，miRNA在包括MM在內(nèi)的許多腫瘤病理生物學(xué)研究中作為重要的基因調(diào)控因子而備受關(guān)注[18]。miR-520g的異位表達(dá)可抵抗5-氟尿嘧啶或奧沙利鉑誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，miR-520g高表達(dá)可促進(jìn)卵巢癌對鉑類藥物化療的化學(xué)耐藥性[19]。miR-520g和 miR-520h都位于19號染色體上，屬于miR-515家族成員。有研究報道，miR-520h通過抑制組蛋白脫乙酰酶1表達(dá)促進(jìn)阿霉素誘導(dǎo)的DNA損傷，對胃癌細(xì)胞的耐藥性有一定的抑制作用[19]。有研究在人類胚胎干細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-520h模擬物和抑制劑，發(fā)現(xiàn)其直接參與調(diào)節(jié)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白G2(ATP binding cassette subfamily G member 2，ABCG2)翻譯，ABCG2是一種真核細(xì)胞中普遍存在的、與耐藥性相關(guān)的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白[20]。此外，MM患者存在miRNA表達(dá)失調(diào)，而miR-520g、miR-520h通過抑制APE1表達(dá)影響下游分子Rad51轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致HR失調(diào)[21]。Yuan等[6]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA通過與靶mRNA中3′-UTR的種子序列結(jié)合，發(fā)揮翻譯抑制或mRNA降解的功能，而miR-520g/h與APE1 mRNA的3′-UTR之間可能存在結(jié)合位點。本研究發(fā)現(xiàn)，MM組血清miR-520g、miR-520h表達(dá)水平顯著低于健康組，且BTZ初治敏感組患者血清miR-520g、miR-520h表達(dá)水平高于難治組，說明miR-520g、miR-520h與BTZ治療反應(yīng)性有關(guān)。采用多因素Logistic回歸模型分析，血清miR-520g>0.765、miR-520h>0.685是影響MM患者BTZ治療早期反應(yīng)性的獨立保護(hù)因素(P<0.05)。血清miR-520g、miR-520h聯(lián)合預(yù)測BTZ初治MM早期反應(yīng)性的AUC高于兩項指標(biāo)單獨預(yù)測，且AUC>0.7，提示兩項指標(biāo)聯(lián)合對于預(yù)測BTZ初治MM早期反應(yīng)性具有較高的臨床價值。

綜上所述，血清miR-520g、miR-520h表達(dá)水平與BTZ初治MM患者的早期反應(yīng)性有關(guān)，血清miR-520g、miR-520h水平越高，MM患者接受BTZ初治的早期反應(yīng)性越好。檢測血清miR-520g、miR-520h水平可預(yù)測BTZ初治MM患者的早期反應(yīng)性，具有一定臨床研究價值。但本研究仍處于初步探索階段，仍需要更多的基礎(chǔ)研究來進(jìn)一步證實miR-520g、miR-520h在BTZ耐藥機制中的作用。