林曉晴，杜世佳，詹昊霖，黃玉清，陳 忠

基于純化學(xué)位移的同核二維正交相敏分解核磁共振波譜

林曉晴，杜世佳，詹昊霖，黃玉清，陳 忠*

廈門大學(xué) 電子科學(xué)系，福建省等離子體與磁共振研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361005

二維分解（2DRES）核磁共振（NMR）波譜是一種簡(jiǎn)單且用戶友好的譜圖表達(dá)形式，其將偶合常數(shù)和化學(xué)位移信息分離到兩個(gè)正交的頻率維度上．自40年前首次被提出以來，2DRES技術(shù)在脈沖序列和方法的改進(jìn)，以及實(shí)際應(yīng)用的進(jìn)展方面一直備受關(guān)注．本文回顧了新型2DRES脈沖序列，以及用于精確測(cè)量同核偶合常數(shù)的2D編輯譜的最近進(jìn)展，特別是基于純化學(xué)位移演化機(jī)制的正交相敏2DRES譜方法及其應(yīng)用，并闡述其在克服強(qiáng)偶合效應(yīng)和磁場(chǎng)不均勻性等方面的能力.

核磁共振；分解譜；相敏；G-SERF；偶合常數(shù)；純化學(xué)位移

引 言

作為一種無損高效檢測(cè)技術(shù)，核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）已成為化合物成分分析和結(jié)構(gòu)解析的重要手段，廣泛用于生物、醫(yī)藥、化學(xué)等領(lǐng)域[1-8]．鑒于1H核的高天然豐度和高檢測(cè)靈敏度，1H NMR目前已成為最常用的一種NMR技術(shù)．1H NMR波譜能夠提供化學(xué)位移、偶合常數(shù)、譜峰積分面積和裂分模式等信息，用于物質(zhì)成分分析和分子結(jié)構(gòu)解析；通過增加維度，還能進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析．然而由于1H核本身有限的化學(xué)位移分布范圍和豐富的偶合裂分，1H NMR譜圖往往會(huì)出現(xiàn)譜峰擁擠甚至重疊現(xiàn)象，嚴(yán)重阻礙了譜峰的準(zhǔn)確歸屬和分析．解決這一問題最直接的方式就是通過提高磁場(chǎng)強(qiáng)度來分散譜峰分布，從而緩解譜圖擁擠情況，但這一方法是基于譜儀硬件的改進(jìn)和提升，成本較高，并且效果相對(duì)有限．另一種行之有效的方式是通過設(shè)計(jì)特定的脈沖序列來改變譜峰分布或呈現(xiàn)形式，提升譜圖分辨率．

目前，用于改善1H NMR譜峰擁擠的脈沖序列優(yōu)化主要集中于純化學(xué)位移方法[9-11]，這一方法的原理是消除偶合裂分，將多重譜峰簡(jiǎn)化為單峰，從而解決譜峰擁擠的問題．經(jīng)歷了幾十年的探索和改進(jìn)，相關(guān)的研究者已開發(fā)了多種不同的純化學(xué)位移方法．而近期相關(guān)的主流技術(shù)是將選擇性翻轉(zhuǎn)模塊與自旋回波模塊相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)偶合演化重聚；再通過干涉圖或?qū)崟r(shí)采樣重構(gòu)出純化學(xué)位移演化的信號(hào)；最終經(jīng)過傅里葉變換得到相敏一維純化學(xué)位移譜圖．純化學(xué)位移技術(shù)能夠大幅提高一維1H NMR譜圖的分辨率，克服譜峰擁擠的問題，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品譜峰的正確歸屬．然而，純化學(xué)位移實(shí)驗(yàn)是以犧牲偶合為代價(jià)實(shí)現(xiàn)，但偶合裂分往往包含偶合常數(shù)、偶合關(guān)系等有助于結(jié)構(gòu)解析和構(gòu)象分析的有效信息[2,12-16]．如何在獲得純化學(xué)位移譜圖的同時(shí)，又保留偶合信息，對(duì)于1H NMR譜圖在復(fù)雜樣品體系的更廣泛應(yīng)用具有重要意義，非常值得關(guān)注和研究．

二維分解（2DRES）譜[17-19]是一種能直觀滿足上述要求的波譜方法，其常用序列如圖1所示．它能夠?qū)⒒瘜W(xué)位移和偶合信息分解到兩個(gè)不同維度，在得到純化學(xué)位移信息的同時(shí)，保留偶合信息，適用于譜峰擁擠嚴(yán)重的復(fù)雜樣品的分析[20-23]．然而，由于2DRES譜間接維的自旋回波演化形式往往會(huì)導(dǎo)致譜峰信號(hào)的相位扭曲，這一相位扭曲無法通過相位校正來消除，因而只能使用絕對(duì)值模式顯示，從而導(dǎo)致譜峰強(qiáng)度失真和譜圖分辨率降低，并造成譜線展寬的問題．特別在復(fù)雜樣品檢測(cè)時(shí)，2DRES譜在絕對(duì)值模式下進(jìn)行45?譜圖旋轉(zhuǎn)處理后，產(chǎn)生的譜峰變形會(huì)影響譜圖分析和偶合常數(shù)的精確測(cè)量[24]．盡管45?譜圖旋轉(zhuǎn)后的2DRES譜在水平1=0軸上表現(xiàn)出特征對(duì)稱性，可通過沿1=0軸的“對(duì)稱化數(shù)據(jù)”操作來去除雜峰，然而其代價(jià)是會(huì)降低某些信號(hào)的強(qiáng)度，同時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生偽峰．如圖2(a)所示的雌二醇的1D1H NMR譜圖中，譜峰嚴(yán)重重疊．其2DRES譜[圖2(b)]經(jīng)過45?譜圖旋轉(zhuǎn)和“對(duì)稱化數(shù)據(jù)”操作，已將化學(xué)位移和偶合信息分解到兩個(gè)正交維度．對(duì)于不擁擠區(qū)域的信號(hào)，如H2.52處譜峰，其化學(xué)位移和偶合信息都能得到很好地歸屬和測(cè)量．但對(duì)于H1.31～1.76的譜峰來說，其信號(hào)呈現(xiàn)出譜線展寬、分辨率下降的問題，無法正確獲得所需要的信息．

圖1 2DRESNMR實(shí)驗(yàn)的脈沖序列示意圖

Fig. 1 Pulse sequence diagram of 2DRESNMR experiments

圖2 500 MHz Varian譜儀所采集的雌二醇（溶于DMSO-6，濃度為200 mmol/L）的(a) 1D1H NMR譜和(b) 2DRES譜

Fig. 2 (a)1H NMR and (b) 2D-resolved spectra of 200 mmol/L estradiol (dissolved in DMSO-6) acquired on Varian spectrometer at 500 MHz

針對(duì)2DRES譜圖相位扭曲的問題，可利用偽回波加權(quán)函數(shù)來直接抑制譜圖信號(hào)中的色散成分，從而保留吸收線形信號(hào)[25]，但其代價(jià)是信號(hào)強(qiáng)度失真．也可以通過不需要傅里葉變換的方法來重建相敏2DRES譜圖，例如正則求解變換[26,27]和濾波對(duì)角化[28,29]方法．另一種解決相位扭曲的常用方法是將型和型兩種正交譜圖相結(jié)合，從而獲得相敏2DRES譜[30]．但2DRES實(shí)驗(yàn)的脈沖序列沒有混頻演化周期，單次實(shí)驗(yàn)不可能通過直接相位循環(huán)設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)型和型譜的相干轉(zhuǎn)移路徑切換．現(xiàn)有的解決方法是在2DRES脈沖序列中引入-filter和片層選擇（Zangger-Sterk，ZS）[31]等特殊的脈沖模塊，并進(jìn)行兩次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，最終獲得純吸收模式的相敏2DRES譜，如Pell-Keeler方法[32]和梯度編碼選擇重聚（Gradient-encoded SElective ReFocusing，G-SERF）方法[33,34]．此外，通過引入PSYCHE（Pure Shift Yielded by CHirp Excitation）模塊[35]來替代-filter或ZS模塊的TSE (Triple Spin-Echo)-PSYCHE 2D[36]或PSYCHEDELIC（Pure Shift Yielded by CHirp Excitation to DELiver Individual Couplings）[37]，也能獲得純吸收模式的2DRES譜效果．相比于結(jié)合-filter和ZS的相敏2DRES譜，使用TSE-PSYCHE-2D和PSYCHEDELIC獲得的2DRES譜具有更高的信噪比．但以上這些相敏RES譜仍需要通過45?譜圖旋轉(zhuǎn)操作來實(shí)現(xiàn)化學(xué)位移和偶合信息的分離．作為TSE-PSYCHE 2D的擴(kuò)展方法，-filter TSE-PSYCHE 2D[24]和PS(pure shift)-TSE-PSYCHE 2D[38]被用于獲取正交模式相敏2DRES譜．這種譜圖模式由Nagayama[39]首次提出，能夠直接分離化學(xué)位移和偶合，避免45?譜圖旋轉(zhuǎn)操作．然而，為了得到純化學(xué)位移維度，需要增加一個(gè)額外的間接維，因此-filter TSE-PSYCHE 2D和PS-TSE-PSYCHE 2D這兩種方法都不可避免地需要冗長(zhǎng)的采樣時(shí)間．上述所有相敏2DRES譜均是通過型和型兩次正交譜圖相結(jié)合實(shí)現(xiàn)的，這就要求兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的信號(hào)峰值強(qiáng)度必須保持一致，以保證色散成分完全消除，然而這一基本要求可能會(huì)增加實(shí)驗(yàn)操作的復(fù)雜性.

除了相位扭曲，強(qiáng)偶合偽峰也是RES譜存在的固有問題．強(qiáng)偶合偽峰是強(qiáng)偶合自旋體系在自旋回波模塊（1/2-π-1/2）中π脈沖的混合作用下產(chǎn)生的．雖然強(qiáng)偶合效應(yīng)并非RES譜想要獲取的信息，但它通常與RES譜所期望獲取的信號(hào)共享相干轉(zhuǎn)移路徑，因而不能通過常規(guī)的相位循環(huán)設(shè)計(jì)來消除．一種基于1周期演化模塊設(shè)計(jì)的改進(jìn)型2DRES譜技術(shù)可以用來抑制這些強(qiáng)偶合偽峰[40]，然而這一方法會(huì)增加采樣時(shí)間．針對(duì)強(qiáng)偶合偽峰非對(duì)稱多重結(jié)構(gòu)，一種結(jié)合對(duì)稱化處理的雙自旋回波2DRES譜方法被提出用于減少這些強(qiáng)偶合偽峰[40]．由于一些對(duì)稱的頻率無法被移除，因而這一對(duì)稱化處理方法往往不適用于復(fù)雜樣品體系．此外，在實(shí)際2DRES譜應(yīng)用中，采樣效率也是需要考慮的另一重要因素[41-43]．與其他2D NMR實(shí)驗(yàn)相比，常規(guī)的2DRES譜間接維譜寬相對(duì)較窄，僅覆蓋了裂分頻率范圍，在采樣效率上具有一定優(yōu)勢(shì)．然而，在強(qiáng)偶合體系應(yīng)用中，往往需要采樣足夠多的間接維演化點(diǎn)數(shù)來獲得高分辨率的譜圖，以保證強(qiáng)偶合裂分的精確測(cè)量，這就大幅延長(zhǎng)了2DRES譜的采樣時(shí)間．

針對(duì)常規(guī)2DRES譜中所遇到問題，為滿足2DRES譜應(yīng)用于復(fù)雜樣品體系的需求，我們小組基于純化學(xué)位移演化模塊和回波鏈采樣模塊，提出了正交相敏2DRES譜方法，包括RASA2D（Rapid Absorption-mode and Strong-coupling Artifact-reduction 2D-resolved spectroscopy）、OPAM-2D（Orthogonal-Pattern Absorption-Mode 2D-resolved spectroscopy）和HR-G-SERF（High-Resolution Gradient-encoded SElective ReFocusing）/AH-G-SERF（Accelerated High-resolution Gradient-encoded SElective ReFocusing）.下文我們對(duì)這三種正交相敏2DRES譜方法進(jìn)行回顧，重點(diǎn)闡述其方法原理和應(yīng)用特性．

1 基于PSYCHE的正交相敏2D JRES方法—RASA2DJ

RASA2D是一種在高采樣效率前提下，能克服強(qiáng)偶合的正交相敏2DRES譜方法[44]，其脈沖序列如圖3所示．該脈沖序列融合了PSYCHE純化學(xué)位移模塊和回波鏈采樣模塊，即將一維PSYCHE序列的采樣部分替換成回波鏈采樣模塊，從而得到正交2DRES譜，不需要45?譜圖旋轉(zhuǎn)操作，即可直接將偶合和化學(xué)位移信息分解在兩個(gè)正交的維度，相當(dāng)于每個(gè)譜峰的化學(xué)位移點(diǎn)在其相應(yīng)垂直方向上添加了相應(yīng)的偶合裂分信息．此外，還可通過在第一個(gè)非選擇性π/2脈沖前添加一個(gè)預(yù)飽和壓水（Presat）模塊來實(shí)現(xiàn)一些實(shí)際應(yīng)用所需的壓水操作．這里的PSYCHE模塊包含了一個(gè)非選擇性π/2激發(fā)脈沖、一個(gè)被二等分的間接演化周期1、一個(gè)具有相干選擇梯度的非選擇性π/2脈沖和一對(duì)具有相干選擇梯度且匹配弱梯度的掃頻Chirp脈沖．回波序列采樣模塊由直接采樣周期2和π脈沖組成，包含奇數(shù)和偶數(shù)采樣部分，并重復(fù)次．RASA2D數(shù)據(jù)采樣完后，需要經(jīng)過后續(xù)數(shù)據(jù)重構(gòu)和相應(yīng)相敏處理來最終得到相敏2DRES譜圖．在數(shù)據(jù)重構(gòu)過程中，通常只用RASA2D數(shù)據(jù)的奇數(shù)回波采樣部分，先經(jīng)過數(shù)據(jù)拼接得到直接維純化學(xué)位移數(shù)據(jù)，接著按照22間接維演化時(shí)間間隔，對(duì)拼接后的一維純化學(xué)位移數(shù)據(jù)進(jìn)行排序，最終重構(gòu)得到2DRES譜數(shù)據(jù)．這一重構(gòu)二維數(shù)據(jù)直接經(jīng)過二維傅里葉變換即可得到正交2DRES譜，即直接維包含純化學(xué)位移信息，而間接維包含偶合信息．但這個(gè)二維譜信號(hào)在兩個(gè)不同維度上均受到相位扭曲的影響，我們?cè)O(shè)計(jì)了特定數(shù)據(jù)相敏處理操作來獲得最終的相敏2DRES譜，具體流程如圖3(b)所示．首先，傅里葉變換后的原始正交2DRES譜經(jīng)過1￠維反轉(zhuǎn)操作，并與原有譜圖進(jìn)行相加，可直接消除1￠維信號(hào)相位扭曲，即消除信號(hào)色散部分而保留吸收信號(hào)部分；接著，沿著2￠維進(jìn)行相應(yīng)相位校正，得到純吸收線形顯示的相敏2DRES譜.

圖3 基于PSYCHE的正交相敏2DRES譜—RASA2D. (a) 脈沖序列，由1D PSYCHE和回波鏈采樣模塊組成．在第一個(gè)非選擇性π/2脈沖之前適用了一個(gè)預(yù)飽和（Presat）模塊進(jìn)行水峰抑制．長(zhǎng)條形脈沖分別代表π/2和π脈沖，兩個(gè)帶有斜箭頭的半圓形代表小翻轉(zhuǎn)角（<< π/2）的掃頻方向相反的脈沖，1和2是相干選擇梯度，3是與掃頻脈沖配合使用的弱梯度，1是間接維演化時(shí)間，2是直接維采樣時(shí)間，SW1是1對(duì)應(yīng)的譜寬，是相鄰兩個(gè)π脈沖之間的間隔．(b)以二維相敏譜中的單峰信號(hào)為例展示數(shù)據(jù)相敏處理流程，包括關(guān)于1￠=0軸翻轉(zhuǎn)原始譜圖后，將其與原始譜圖相加，并將相加后的譜圖沿2￠維進(jìn)行一維相位校正可得相敏結(jié)果（摘自文獻(xiàn)[44]）

Fig. 3 PSYCHE based orthogonal-pattern phase-sensitive-resolved spectroscopy, RASA2D. (a) Pulse sequence diagram constituted of 1D PSYCHE and echo-trainacquisition module. A presaturation (Presat) module is adopted before the first nonselective π/2 pulse for water suppression. Vertical bars indicate nonselective π/2 and π pulses, two semicircle shaped pulses with diagonal arrows are frequency-swept chirp pulses with small flip angle? π/2,1and2are coherence selection gradients,3is a weak gradient matching with chirp pulses,1is the indirect evolution period and2is the direct acquisition period, SW1 is the spectral width corresponding to1, andis the time interval between two adjacent π pulses. (b) The procedure of phase-sensitive processing is illustrated using a singlet peak in a 2D phase-sensitive spectrum, including preserving an original spectrum and generating an1￠-reversed spectrum, summing these two spectra, and performing 1D phase correction along the2￠dimension (Excerpted from Ref. [44])

圖4所示為RASA2D方法應(yīng)用于具有小偶合常數(shù)體系和復(fù)雜樣品體系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[44]．使用RASA2D所得到2DRES譜圖中，所有譜峰信號(hào)均顯示為吸收線形模式，相比于傳統(tǒng)2DRES譜的絕對(duì)值顯示模式，譜圖分辨率提高了2倍．由于采用回波鏈采樣模式，即在回波鏈采樣過程實(shí)現(xiàn)偶合演化，RASA2D只需要單次實(shí)驗(yàn)就可以記錄完整偶合演化過程，不需要通過相位循環(huán)設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)型和型譜的相干轉(zhuǎn)移路徑切換，避免了冗長(zhǎng)間接維點(diǎn)數(shù)的遞進(jìn)演化．因此RASA2D可在偶合維度上實(shí)現(xiàn)非常高的分辨率，特別有利于小偶合常數(shù)的測(cè)量．如圖4左側(cè)所示，利用RASA2D得到的2DRES譜可以測(cè)量在常規(guī)1D NMR譜無法獲得的偶合常數(shù)0.5 Hz和0.8 Hz，其實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置如下：非選擇性π/2脈沖寬度為12.8 μs；每個(gè)Chirp脈沖長(zhǎng)度為15 ms；掃頻寬度為10 kHz；翻轉(zhuǎn)角度為12?；相干選擇梯度1和2的強(qiáng)度分別為0.20 T/m和0.32 T/m，持續(xù)時(shí)間為1.5 ms；弱梯度3的強(qiáng)度為0.009 T/m；采樣時(shí)間2為11.1 ms；回波鏈采樣模塊的重復(fù)次數(shù)為80，重建的偶合維度的譜寬為45 Hz（1/(22)）；間接維譜寬SW1和SW2分別為90 Hz和9 kHz；脈沖重復(fù)時(shí)間為2.0 s；1增量的數(shù)量和實(shí)驗(yàn)累加次數(shù)分別為60和2．RASA2D應(yīng)用于復(fù)雜樣品體系時(shí)也獨(dú)具優(yōu)勢(shì)，如圖4右側(cè)所示，RASA2D方法用于高分辨檢測(cè)復(fù)雜的雌二醇樣品時(shí)，在直接維顯示了相敏純化學(xué)位移譜，在間接維垂直正交顯示與分子結(jié)構(gòu)解析相關(guān)的偶合裂分信息．與前一實(shí)驗(yàn)不同的參數(shù)設(shè)置如下：采樣時(shí)間2為10 ms；回波鏈采樣模塊的重復(fù)次數(shù)為50，重建的偶合維度的譜寬為50 Hz；間接維譜寬SW1和SW2分別設(shè)為100 Hz和10 kHz；脈沖重復(fù)時(shí)間為1.5 s；1增量的數(shù)量和實(shí)驗(yàn)累加次數(shù)分別設(shè)為50和4.

圖4 RASA2DJ方法應(yīng)用于具有小J偶合常數(shù)體系和復(fù)雜樣品體系．左側(cè)為溶于DMSO-d6的甲基丙烯酸丁酯的1D NMR譜和RASA2DJ譜，RASA2DJ的總采樣時(shí)間為4 min；右側(cè)為溶于DMSO-d6的雌二醇（部分區(qū)域）的1D NMR譜和RASA2DJ譜，RASA2DJ的總采樣時(shí)間為5 min（根據(jù)文獻(xiàn)[44]修改）

2 基于ZS的正交相敏2D JRES方法—OPAM-2DJ

基于PSYCHE的正交相敏2DRES方法通常僅適用于均勻磁場(chǎng)環(huán)境．然而，NMR實(shí)際應(yīng)用于非均相生物組織和原位電化學(xué)體系時(shí)，磁場(chǎng)不均勻性往往很難避免，這就導(dǎo)致2DRES譜的譜峰沿化學(xué)位移維度不均勻展寬，給化學(xué)位移和偶合信息的測(cè)量帶來挑戰(zhàn)．為消除這種不均勻譜線展寬效應(yīng)，一系列基于自旋回波相關(guān)（spin-echo correlation，SECSY）模塊[45]和分子間多量子相干演化（intermolecular multiple-quantum coherence，iMQCs）[46]的高分辨2DRES方法相繼被提出．雖然這些高分辨方法能應(yīng)用于不均勻磁場(chǎng)，但它們通常仍無法獲得相敏模式的2DRES譜圖．

基于ZS純化學(xué)演化模塊與回波鏈采樣模塊，我們提出了一種稱為OPAM-2D[47]的改進(jìn)2DRES方法，可用于不均勻磁場(chǎng)環(huán)境下正交相敏2DRES譜的采集，其脈沖序列如圖5所示．圖5(a)是單層激發(fā)版本的OPAM-2D序列；圖5(b)是多層激發(fā)版本的OPAM-2D序列，使用傅里葉相位編碼方法進(jìn)行多層信號(hào)解碼．與RASA2D方法不同的是，OPAM-2D方法將一對(duì)掃頻Chirp脈沖換成了一個(gè)選擇性π脈沖，由選擇性π脈沖和弱梯度結(jié)合使用的模塊實(shí)現(xiàn)片層選擇．最終，譜圖上的每個(gè)信號(hào)都來源于一個(gè)與位置相關(guān)的特定小體素片層，這是OPAM-2D能夠克服不均勻場(chǎng)的原因之一．另一個(gè)原因是這一方法使用了回波鏈采樣模塊，這一模塊能夠重聚在采樣期間的磁場(chǎng)不均勻效應(yīng)，減少了不均勻磁場(chǎng)對(duì)譜圖的影響．圖6為使用常規(guī)2DRES方法與OPAM-2D方法在不均勻磁場(chǎng)環(huán)境下獲得的25 mmol/L溶于DMSO-6的阿奇霉素樣品的譜圖對(duì)比[47]．由圖6(a)可以看出，由于磁場(chǎng)不均勻效應(yīng)導(dǎo)致譜線大幅增寬，使用常規(guī)2DRES方法獲得的譜圖幾乎無法提供有用的信息．而使用單層激發(fā)OPAM-2D方法在不均勻場(chǎng)下采集的2DRES譜[圖6(b)]以正交相敏模式顯示，在直接維可獲得純化學(xué)位移譜峰信息，而間接維給出偶合信息，該實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置如下：相干選擇梯度1、2和3的強(qiáng)度為11 G/cm（1 G/cm=10-4T/cm）、11 G/cm和-22 G/cm，持續(xù)時(shí)間為1.0 ms；弱梯度z的強(qiáng)度為0.37 G/cm；相干選擇梯度4的強(qiáng)度為0 G/cm；單色π脈沖寬度為13.9 ms；1增量的數(shù)量為40；單個(gè)回波鏈采樣模塊的采樣時(shí)間為10.25 ms；回波鏈采樣模塊的重復(fù)次數(shù)為50；直接維譜寬SW和間接維譜寬SW1分別設(shè)為10 kHz和100 Hz.

圖5 (a)單層激發(fā)和(b)多層激發(fā)的OPAM-2D實(shí)驗(yàn)的脈沖序列示意圖．該序列由純化學(xué)位移ZS模塊和回波鏈采樣模塊組成．綠色填充代表π/2和π非選擇性脈沖；紅色填充代表單色π脈沖；黃色填充代表多色π/2和π脈沖；z為與空間選層脈沖相匹配的弱梯度；1、2、3和4是相干選擇路徑梯度；m,n為附加的傅里葉編碼相位；序列的相位為：1(, ?)、2()、3(,,,,-,-,-,-)、rec(,,,)；4在回波鏈采樣模塊中，遵循(,,-,-)的相位（摘自文獻(xiàn)[47]）

Fig. 5 Pulse sequences for (a) single-band and (b) multi-band OPAM-2Dexperiments. The sequence is constituted of ZS and echo-trainacquisition modules. Green bars denote π/2 and π nonselective pulses, respectively. The red-shaped pulse represents monochromatic π pulse. The yellow-shaped pulses represent polychromatic π/2 and π pulses.zindicates the weak gradient for extracting spatial slice-selective signals;1,2,3,4are used for coherence pathway selection.m,nis the appended Fourier encoding phase. Phase cycling:1(, ?),2(),3(,,,, ?, ?, ?, ?),rec(,,,).4is varied as (,, ?, ?) in the echo-trainacquisition module (Excerpted from Ref. [47])

圖6 在不均勻磁場(chǎng)環(huán)境下獲得的(a)常規(guī)2D JRES譜和(b)單層激發(fā)OPAM-2DJ譜（根據(jù)文獻(xiàn)[47]修改）

OPAM-2D方法能夠記錄正交模式2DRES譜，純化學(xué)位移和偶合信息分別在正交維上呈現(xiàn)，避免了45?譜圖旋轉(zhuǎn)．在采樣效率方面，亦能夠在幾分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速2D采樣．同時(shí)，得到的OPAM-2D譜圖可以相敏模式顯示，減少的強(qiáng)偶合偽峰帶來的影響．相比于RASA2D方法，OPAM-2D還能克服沿方向的主磁場(chǎng)的不均勻性，從而實(shí)現(xiàn)非理想磁場(chǎng)條件下復(fù)雜樣品體系偶合信息測(cè)量與多重結(jié)構(gòu)的分析，使獲得具有固有磁化率變化的生物組織的檢測(cè)分析成為可能.

3 應(yīng)用于非均勻磁場(chǎng)下高分辨2D J-編輯譜方法

2DRES譜可用于提取和識(shí)別重疊區(qū)域每個(gè)質(zhì)子的多重偶合信息，無需預(yù)先獲知質(zhì)子準(zhǔn)確化學(xué)位移信息就能實(shí)現(xiàn)其偶合常數(shù)的測(cè)量．然而這一方法只能獲得特定質(zhì)子的所有偶合信息．為了提取特定相互作用下單個(gè)偶合信息，Berger等[48]提出了雙重選擇重聚（SElective ReFocusing，SERF）方法，每次實(shí)驗(yàn)所提取的偶合信息僅限于所選擇的兩個(gè)自旋偶合質(zhì)子之間．若要得到全部的偶合網(wǎng)絡(luò)信息，需要重復(fù)多次實(shí)驗(yàn)，采樣效率相對(duì)較低．此后，G-SERF[49]被提出來用于在一次實(shí)驗(yàn)中得到與選定質(zhì)子偶合相關(guān)的所有偶合信息，大幅度提升了實(shí)驗(yàn)效率．Clean-G-SERF[50]是G-SERF的改進(jìn)版本，可用于消除軸峰和不需要的偶合信號(hào)，簡(jiǎn)化偶合網(wǎng)絡(luò)信息表達(dá)．此外，SECT（SElective Constant-Time）[51,52]方法也可以在高信噪比的情況下顯示出理想的偶合信息．目前，這些SERF方法應(yīng)用于復(fù)雜樣品體系時(shí)，能起到簡(jiǎn)化譜峰信息、實(shí)現(xiàn)特定偶合網(wǎng)絡(luò)編輯譜功能的作用．除譜峰擁擠外，空間磁場(chǎng)非均勻變化也是降低2D編輯譜譜圖分辨率、阻礙其應(yīng)用的另一因素．在液態(tài)均相樣品實(shí)驗(yàn)中，可通過勻場(chǎng)技術(shù)來使外部磁場(chǎng)達(dá)到均勻狀態(tài)．然而，在非均相半固態(tài)樣品應(yīng)用測(cè)量時(shí)，例如具有固有磁化率變化的生物組織等，普遍存在難以消除的磁場(chǎng)不均勻性，即使對(duì)于均勻樣品，輕微的磁場(chǎng)擾動(dòng)也能導(dǎo)致譜圖信息模糊，干擾特征譜峰信息識(shí)別，尤其是對(duì)于復(fù)雜樣品體系．理論上，基于G-SERF模塊的方法可以解決沿梯度編碼方向（通常為軸）的磁場(chǎng)空間非均勻變化問題．然而，這些方法在不利磁場(chǎng)條件下的應(yīng)用都還尚未得到深入研究．

基于此，我們小組提出了可應(yīng)用于不均勻磁場(chǎng)環(huán)境下獲得高分辨2D-編輯譜的方法，包括基于3D采樣的HR-G-SERF方法和基于2D快速采樣的AH-G-SERF方法，同時(shí)解決2D-編輯譜應(yīng)用中存在的譜峰擁擠和由磁場(chǎng)不均勻性導(dǎo)致的譜圖分辨率下降的問題，而且最終得到的譜圖以正交相敏顯示，避免常規(guī)2D編輯譜所需的45?譜圖旋轉(zhuǎn)操作[53]．圖7(a)為HR-G-SERF脈沖序列，其信號(hào)演化隨1增量的變化僅受到所選質(zhì)子與其偶合核之間的偶合調(diào)制作用，從而在1維上揭示了偶合網(wǎng)絡(luò)關(guān)系．在2維中，純化學(xué)位移隨變量2演化消除偶合作用．最終在兩個(gè)正交維度（1和2）上得到其偶合信息和純化學(xué)位移信息．再將譜圖進(jìn)行相應(yīng)相敏處理，即關(guān)于1=0軸對(duì)稱后與原譜圖相加，即可得到相敏2D-編輯譜．該序列中使用了ZS模塊，能實(shí)現(xiàn)小體素片選信號(hào)的積分，因而能在一定程度上抑制磁場(chǎng)不均勻性對(duì)譜圖的干擾．圖7(b)為AH-G-SERF脈沖序列，由ZS模塊和G-SERF回波鏈模塊組成．通過使用回波鏈，AH-G-SERF將2D-編輯譜實(shí)驗(yàn)中3D采樣壓縮為2D采樣，進(jìn)一步提高了采樣效率．

上述兩種高分辨2D-編輯譜方法可以在一次實(shí)驗(yàn)中確定與選定質(zhì)子相關(guān)的整個(gè)偶合網(wǎng)絡(luò)；同時(shí)能夠?qū)⒓兾漳Ｊ?D編輯譜變換成正交模式，讓純化學(xué)位移沿直接維分布，而偶合信息沿正交間接維分布，便于在擁擠NMR譜中進(jìn)行偶合網(wǎng)絡(luò)信息測(cè)量；而且，能夠克服方向磁場(chǎng)不均勻性，可用于非均勻相樣品體系，如生物組織的高分辨檢測(cè)[46,54-56]．圖8為使用HR-G-SERF方法在均勻和非均勻磁場(chǎng)條件下獲得的250 mmol/L溶于DMSO-6的雌二醇樣品的-編輯譜[53]．結(jié)果顯示，在均勻場(chǎng)和不均勻場(chǎng)下，復(fù)雜樣品的偶合常數(shù)都能夠得到精確測(cè)量，相應(yīng)的偶合網(wǎng)絡(luò)關(guān)系也能夠得到正確歸屬．在3D HR-G-SERF實(shí)驗(yàn)[對(duì)應(yīng)圖8(c)、8(d)、8(f)、8(g)的實(shí)驗(yàn)]中，實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置如下：相干選擇梯度1、2的強(qiáng)度為3.7 G/cm、7.3 G/cm，持續(xù)時(shí)間為0.5 ms；弱梯度z的強(qiáng)度為0.37 G/cm；直接維譜寬SW為5 000 Hz，采樣點(diǎn)數(shù)為3 968；對(duì)應(yīng)偶合演化的間接維譜寬SW1設(shè)為20 Hz，1增量的數(shù)量設(shè)為40；對(duì)應(yīng)純化學(xué)位移演化的間接維譜寬SW2設(shè)為50 Hz，2增量的數(shù)量設(shè)為25．用于重聚激發(fā)H-9及H-15的選擇性脈沖寬度設(shè)為25 ms，與弱梯度z一起的選擇性脈沖寬度設(shè)為25 ms；掃描間延遲時(shí)間1設(shè)為1s；空掃次數(shù)設(shè)為16；實(shí)驗(yàn)累加次數(shù)設(shè)為8；總實(shí)驗(yàn)時(shí)間約為4 h 30 min．在僅遞增1的HR-G-SERF實(shí)驗(yàn)中，與3D HR-G-SERF實(shí)驗(yàn)不同的實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置如下：直接維譜寬SW設(shè)為10 000 Hz，采樣點(diǎn)數(shù)為20 000；對(duì)應(yīng)偶合演化的間接維譜寬SW1設(shè)為20 Hz，1增量的數(shù)量設(shè)為30，總實(shí)驗(yàn)時(shí)間為6 min．

圖7 應(yīng)用于不均勻磁場(chǎng)下的高分辨2D J-編輯譜方法. (a)基于3D采樣的HR-G-SERF實(shí)驗(yàn)序列，相位循環(huán)：Φ1 (x, ?x), Φ2 (x), Φ3 (x, x, y, y, ?x, ?x, ?y, ?y), Φrec (x, ?x, ?x, x). (b)基于2D快速采樣的AH-G-SERF實(shí)驗(yàn)序列，由ZS模塊和G-SERF回波鏈模塊組成設(shè)計(jì)的，相位循環(huán)：Φ1=Φ2=Φ3=Φrec=x，Φ4在J編輯回波鏈采樣模塊中以(x, x, x, x, -x, -x, -x, -x)N/2為循環(huán)．細(xì)綠色長(zhǎng)條和粗綠色長(zhǎng)條分別表示π/2和π非選擇性脈沖，藍(lán)色和紅色填充形狀表示的分別是用于選擇特定質(zhì)子和空間編碼的π選擇性脈沖；Gz為空間編碼的弱梯度，G1、G2、G3和G4為相干選擇梯度（摘自文獻(xiàn)[53]）

圖8 不同磁場(chǎng)環(huán)境下，使用HR-G-SERF方法獲得的雌二醇樣品的高分辨2D J-編輯譜. (a)分子結(jié)構(gòu)信息和所觀察的偶合網(wǎng)絡(luò)；(b～d)均勻磁場(chǎng)下的1D NMR譜、激發(fā)H-9及H-15a的2D J-編輯譜；(e～g)不均勻磁場(chǎng)下的1D NMR譜、激發(fā)H-9及H-15a的2D J-編輯譜（根據(jù)文獻(xiàn)[53]修改）

4 總結(jié)與展望

2DRES譜可通過分離化學(xué)位移和偶合信息，從而解決1D1H NMR譜應(yīng)用于復(fù)雜體系時(shí)遇到的譜峰擁擠問題．本文首先回顧了一系列相關(guān)的2DRES譜方法，然后針對(duì)傳統(tǒng)2DRES譜方法遇到的困境，詳細(xì)介紹了三種基于純化學(xué)位移的正交相敏2DRES譜的原理和應(yīng)用．相比于常規(guī)2DRES譜，正交相敏2DRES譜方法表現(xiàn)出如下優(yōu)勢(shì)：一方面能夠避免45?譜圖旋轉(zhuǎn)操作；另一方面譜圖以相敏模式顯示，提高譜圖分辨率；同時(shí)，這些方法也能一定程度上避免強(qiáng)偶合偽峰的產(chǎn)生；并且，可應(yīng)用于非均勻磁場(chǎng)環(huán)境．相關(guān)實(shí)驗(yàn)也證明了正交相敏2DRES方法可用于生物組織和復(fù)雜樣品體系，以及強(qiáng)偶合體系的偶合信息的準(zhǔn)確測(cè)量．

但由于純化學(xué)位移信號(hào)演化本身固有的信號(hào)強(qiáng)度低的缺點(diǎn)，上述正交相敏2DRES譜也不可避免地存在信噪比損失的問題．如何在不降低采樣效率的前提下，提高譜圖的靈敏度，將成為擴(kuò)展其應(yīng)用范圍的關(guān)鍵．另外，數(shù)據(jù)拼接過程中存在著調(diào)制殘留，使得譜圖中也會(huì)有偽峰的存在，如何去除正交相敏2DRES譜中的偽峰，也值得研究．對(duì)于回波鏈來說，由于只使用了奇數(shù)段，所采樣數(shù)據(jù)只有50%左右的使用率，對(duì)于弛豫時(shí)間很短的樣品來說，這一方法的使用會(huì)受到一定程度限制．以上這些缺陷都可通過優(yōu)化設(shè)計(jì)脈沖序列，或結(jié)合有效的數(shù)據(jù)后處理方法來進(jìn)一步解決．

無

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Two-Dimensional Homonuclear Orthogonal-Pattern Phase-Sensitive-Resolved NMR Spectroscopy Based on Pure Shifts

，，，，CHEN Zhong

Department of Electronic Science, Fujian Provincial Key Laboratory of Plasma and Magnetic Resonance, Xiamen University, Xiamen 361005, China

Two-dimensional-resolved (2DRES) nuclear magnetic resonance (NMR) experiments provide a simple and user-friendly spectral representation, in whichcouplings and chemical shifts are separated into two orthogonal frequency dimensions. The 2DRESexperiments have attracted wide attention in fundamental pulse sequence developments and practical applications, since they were first proposed 40 years ago. In this paper, we review the recent advances in the development of novel 2DRESpulse sequences and 2D-edited methods for accurate measurements ofcoupling, mainly focusing on pure shift based 2D orthogonal-pattern and phase-sensitive 2DRESspectroscopy and their applications in overcoming strong coupling effects and field inhomogeneities.

nuclear magnetic resonance (NMR),-resolved spectroscopy,phase-sensitive,G-SERF,coupling constant, pure shift

O482.53

A

10.11938/cjmr20212929

2021-06-29;

2021-08-10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(U1805261, 22073078, U1632274, 11675135和11761141010).

* Tel: 0592-2183301, E-mail: chenz@xmu.edu.cn.