劉志超，陳金紅，高晟瑋，馬 莉，王治中 ，陸安民，王保和，谷旭放△

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300150)

隨著2018年《心肌梗死全球定義(第四版)》指南的修訂和發(fā)布，急性心肌梗死的診斷與治療更加明確[1]。亞洲地區(qū)各國(guó)的研究也表明，早期出現(xiàn)癥狀與使用藥物介入治療的死亡率低于直接介入治療的死亡率有關(guān)[2，3]，而國(guó)內(nèi)則呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)[4]。抗栓治療是貫穿整個(gè)急性心肌梗死臨床治療的方案，包括經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)術(shù)后，患者需要長(zhǎng)期服用抗血小板、穩(wěn)定斑塊治療[5]。盡管指南中指出，以抗栓治療為主，但存在一定風(fēng)險(xiǎn)，包括出血事件、消化系統(tǒng)不良反應(yīng)。因而課題組致力于探索出一種新的治療策略，通過(guò)中醫(yī)藥的輔助治療起到“增效減毒”作用。

急性心肌梗死根據(jù)其癥狀、證候表現(xiàn)，屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”“真心痛”范疇，最早可追溯至《黃帝內(nèi)經(jīng)》中有所記載?，F(xiàn)代中醫(yī)專家對(duì)急性心肌梗死的證候演變規(guī)律進(jìn)行總結(jié)并達(dá)成共識(shí)，即氣虛、血瘀、痰濁為常見(jiàn)病因病機(jī)，證候組合中，以氣虛血瘀證為主[6]。黃芪-丹參是中醫(yī)臨床益氣活血常用藥對(duì)，現(xiàn)代藥理學(xué)研究也表明[7]，黃芪-丹參配伍提取物在缺血性心肌中能夠有效延緩心肌重塑的進(jìn)展。

本研究初步對(duì)黃芪-丹參組合的相互作用以及對(duì)急性心肌梗死的治療作用進(jìn)行分子機(jī)制預(yù)測(cè)性挖掘，建立可信度較高的研究體系，從分子層面篩選丹參黃芪配伍抗心肌梗死氣虛血瘀證的關(guān)鍵活性成分及靶點(diǎn)，為課題后續(xù)研究把握較為精準(zhǔn)的方向。

1 數(shù)據(jù)庫(kù)建立與研究方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)建立

利用整合藥理學(xué)平臺(tái)[8](http://www.tcmip.cn /)的中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)、證候相關(guān)分子挖掘，結(jié)合2015年版《中國(guó)藥典》中規(guī)范藥材命名及成分名稱，進(jìn)行虛擬數(shù)據(jù)資料建庫(kù)。檢索“黃芪”“丹參”主要生物活性成分，自主命名數(shù)據(jù)作為備用。

1.2 藥物靶標(biāo)預(yù)測(cè)

利用TCMIP通過(guò)提取黃芪-丹參藥物成分的化學(xué)分子指紋，并將其與Drug Bank(https://www.drugbank.ca/)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration,FDA)批準(zhǔn)的抗冠心病心肌梗死藥物指紋進(jìn)行比對(duì)，平臺(tái)利用Tanimoto系數(shù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，選定評(píng)分>0.8的為相似性藥物，將相似性藥物靶點(diǎn)作為黃芪-丹參藥物組合的潛在機(jī)制靶點(diǎn)[9]。

1.3 疾病、證候靶標(biāo)確定

以“myocardial infarction”作為疾病關(guān)鍵詞，在GeneCard(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://omim.org/)、DIGSEE數(shù)據(jù)庫(kù)(http://210.107.182.61/geneSearch/)中進(jìn)行檢索全疾病相關(guān)靶標(biāo)，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/uniprot/)轉(zhuǎn)換蛋白名稱，獲取基因名稱。最終利用Microsoft Office Excel文本進(jìn)行去重，整理疾病靶標(biāo)，建立疾病數(shù)據(jù)庫(kù)。

再以“myocardial infarction”作為疾病關(guān)鍵詞錄入整合藥理學(xué)平臺(tái)疾病/證候靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，證素[10]輸入心胸刺痛、胸部悶滯，動(dòng)則加重，伴乏力、短氣、汗出等進(jìn)行關(guān)鍵詞檢索，提取相應(yīng)證候靶點(diǎn)信息。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、分析與可視化

通過(guò)整合藥理學(xué)平臺(tái)的網(wǎng)絡(luò)分析模塊蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，以“?jié)點(diǎn)連接度”的2倍中位數(shù)為卡值，選取中藥靶點(diǎn)-疾病基因的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)(hubs)；在此基礎(chǔ)上，以“節(jié)點(diǎn)連接度”(degree)“節(jié)點(diǎn)緊密度”(closeness)“節(jié)點(diǎn)介度”(betweenness)的中位數(shù)為截取值，選取同時(shí)滿足3個(gè)卡值的節(jié)點(diǎn)為黃芪-丹參的潛在靶點(diǎn)，然后對(duì)關(guān)鍵靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行通路富集分析，選取統(tǒng)計(jì)值P值排名前20的通路,構(gòu)建完整的“中藥-活性成分-核心靶標(biāo)-關(guān)鍵通路”多層次關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò),并進(jìn)行可視化數(shù)據(jù)分析。采用TCMIP構(gòu)建黃芪-丹參最密切關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)；通過(guò)TCMIP分析平臺(tái)對(duì)關(guān)鍵靶基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG富集分析，利用Jvenn(http://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html)在線繪圖[11]獲取韋恩圖。

2 結(jié)果

2.1 黃芪-丹參成分靶標(biāo)預(yù)測(cè)及分析

通過(guò)TCMIPV2.0平臺(tái)對(duì)黃芪、丹參化學(xué)成分的分析結(jié)果可知，黃芪共收集了27個(gè)化學(xué)成分,包括黃芪甲苷(astragaloside IV，AS-IV)、黃芪多糖(astragalus polysaccharides，APS)、異黃芪皂苷等，其中潛在靶標(biāo)數(shù)量為218個(gè)。丹參共收集96個(gè)化學(xué)成分,主要為丹參素、丹酚酸B、丹酚酸A、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA等，其中潛在靶標(biāo)數(shù)量151個(gè)。

對(duì)黃芪、丹參后選靶標(biāo)進(jìn)行基因功能分析和通路富集分析發(fā)現(xiàn)，其功能多與類固醇激素介導(dǎo)的信號(hào)通路、離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)程通路、細(xì)胞內(nèi)受體信號(hào)通路、氨基丁酸信號(hào)通路、γ-氨基丁酸信號(hào)通路(γ-aminobutyric acid，GABA)、膜電位調(diào)節(jié)、氧化還原過(guò)程通路等相關(guān)。這些候選靶標(biāo)參與通路的信息發(fā)現(xiàn)主要在神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)、心肌能量代謝、脂類代謝等通路。

2.2 心肌梗死疾病靶標(biāo)及相關(guān)基因

研究者對(duì)全疾病相關(guān)潛在靶標(biāo)合并去重后共計(jì)1062個(gè)，其中與黃芪-丹參藥對(duì)組合密切相關(guān)的共同靶向基因共計(jì)49個(gè)，如韋恩圖(見(jiàn)圖1)。這些靶點(diǎn)的作用機(jī)制主要從調(diào)控炎性因子(白介素-2、白介素-6、白介素-8)[12]、凝血因子-2(Recombinant Coagulation Factor II，F(xiàn)2)[13]、基質(zhì)金屬肽酶[14]、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferative activated receptor gamma，PPARG)[15]、腫瘤壞死因子[16]、磷脂酰肌醇-4-磷酸3-激酶催化亞單位2型α[17]、eNOS[18]、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子[19]、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶[20]、細(xì)胞凋亡蛋白酶[21]、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶[22]等共同作用下發(fā)揮作用。

圖1 心肌梗死疾病靶標(biāo)及相關(guān)基因韋恩圖

2.3 心肌梗死氣虛血瘀證素靶標(biāo)

根據(jù)中醫(yī)學(xué)對(duì)氣虛血瘀證的描述，劃分證素包括胸悶、胸痛、乏力、短氣、汗出、舌紫暗、脈虛無(wú)力等。其中血瘀證素(胸悶胸痛)包含159個(gè)相關(guān)靶標(biāo)，氣虛證素(乏力短氣、汗出)包含143個(gè)相關(guān)靶標(biāo)。

2.4 黃芪-丹參抗心肌梗死候選基因的GO富集分析

表1示，通過(guò)對(duì)黃芪-丹參-心肌梗死候選靶標(biāo)進(jìn)行基因功能分析和通路富集分析，羅列出候選作用靶標(biāo)(P值前20的)所具有的功能。由此可見(jiàn)，黃芪-丹參候選靶標(biāo)參與的通路，主要涉及在細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞介導(dǎo)因子、DNA轉(zhuǎn)錄、基因表達(dá)調(diào)控等多方面。

表1 黃芪-丹參抗心肌梗死的候選基因的GO富集分析

2.5 黃芪-丹參抗心肌梗死核心靶標(biāo)的KEGG富集分析

黃芪-丹參抗心肌梗死關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)的KEGG通路富集分析結(jié)果(見(jiàn)表2)，靶標(biāo)主要涉及白介素、腫瘤域突變體、卵巢腫瘤結(jié)構(gòu)域蛋白酶、eNOS、TGF-β受體信號(hào)傳導(dǎo)激活Sma和Mad相關(guān)蛋白(Sma -and Mad -related protein，Smad)通路、激酶非活性BRAF對(duì)加速纖維肉瘤蛋白(rapidly accelerated fibrosarcoma，RAF)信號(hào)的異常激活等角度。

表2 黃芪-丹參抗心肌梗死核心靶標(biāo)的KEGG富集分析

2.6 黃芪-丹參抗心肌梗死的“中藥-成分-靶點(diǎn)-通路”多維網(wǎng)絡(luò)分析

圖2示，基于黃芪-丹參藥靶與心肌梗死靶標(biāo)的PPI 網(wǎng)絡(luò)信息，進(jìn)行構(gòu)建黃芪-丹參治抗心肌梗死的“中藥-成分-靶標(biāo)-通路”多維網(wǎng)絡(luò)圖，不同顏色的節(jié)點(diǎn)是按照基因間相互作用的緊密度進(jìn)行聚類。圖2可直觀看出，黃芪-丹參藥對(duì)通過(guò)中藥材的多成分，從而達(dá)到多途徑、多層次、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的抗心肌梗死作用，能有效預(yù)測(cè)到中藥、證素、疾病、靶點(diǎn)之間可能存在的聯(lián)系，此外復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)圖也間接反映出藥物之間相互作用的復(fù)雜程度。黃芪-丹參藥對(duì)組合共包含123個(gè)化學(xué)成分，潛在靶標(biāo)369個(gè)，這些成分通過(guò)聯(lián)合調(diào)控白介素、腫瘤域突變體、卵巢腫瘤結(jié)構(gòu)域蛋白酶、eNOS、TGF-β、激酶非活性BRAF等靶標(biāo)，直接或間接參與炎癥信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、SMAD通路、RAF信號(hào)的異常激活、調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄等作用。

圖2 黃芪-丹參抗心肌梗死的“中藥-成分-靶點(diǎn)-通路”多維網(wǎng)絡(luò)分析

3 討論

闡明中醫(yī)證候的本質(zhì)，一直是中醫(yī)學(xué)者們力求解決的科學(xué)問(wèn)題之一。中醫(yī)證候往往被拆解為多個(gè)證素進(jìn)行深入挖掘，即按照證候表現(xiàn)將證素劃分到某一西醫(yī)疾病范疇內(nèi)，然后再進(jìn)行分子量級(jí)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究，研究本身具有科學(xué)意義，但研究成果與中醫(yī)的聯(lián)系往往較牽強(qiáng)附會(huì)。此外，天然藥物的成分較為復(fù)雜，成分之間的協(xié)同/拮抗作用尚未完全闡明，因而以單體活性成分代替生藥進(jìn)行生物學(xué)研究欠為妥當(dāng)。整合藥理學(xué)結(jié)合中藥成分、證候要素、疾病靶點(diǎn)的多層次研究，從藥物自身出發(fā)，能夠較為完善地完成中藥-證素-疾病-靶標(biāo)-通路的銜接性研究，形成中醫(yī)藥現(xiàn)代研發(fā)體系，從分子角度解釋中醫(yī)療效內(nèi)涵。

本研究旨在探討中藥抗心肌梗死氣虛血瘀證證候本質(zhì)，完善現(xiàn)有證據(jù)，并提出新的中醫(yī)證候本質(zhì)研究策略。目前國(guó)內(nèi)諸多團(tuán)隊(duì)都在進(jìn)行這一工作，其中韓晶巖教授團(tuán)隊(duì)對(duì)此進(jìn)行了深入研究[23]，對(duì)芪參益氣滴丸通過(guò)心肌能量代謝途徑、心肌線粒體復(fù)合物及其亞單位、調(diào)控線粒體復(fù)合物去乙?；?1、小G蛋白家族的Ras同系物家族成員A(ras homolog family member A,RhoA)/Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶-1(rho-associated coiled-coil kinases1,ROCK1)、細(xì)胞骨架、心肌結(jié)構(gòu)、心功能、心臟微循環(huán)動(dòng)態(tài)等綜合研究，部分闡明了心氣虛血瘀的科學(xué)內(nèi)涵，揭示了補(bǔ)氣活血的作用機(jī)理，及其主要成分協(xié)同作用的機(jī)理，支撐了益氣活血藥物在治療心肌缺血再灌注損傷和心肌肥厚方面的應(yīng)用。

本研究借助智能化數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)TCMIP v2.0和國(guó)際通用靶標(biāo)、基因數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)益氣活血藥對(duì)黃芪-丹參的藥物候選靶標(biāo)與疾病進(jìn)行關(guān)聯(lián)，并以網(wǎng)絡(luò)可視化形式展現(xiàn)出來(lái)，預(yù)測(cè)其可能靶標(biāo)和分子信號(hào)通路。分析結(jié)果表明，黃芪-丹參能夠聯(lián)合調(diào)控炎性因子、信號(hào)通路、調(diào)節(jié)能量代謝、調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。此外，多維網(wǎng)絡(luò)分析顯示，黃芪-丹參潛在靶標(biāo)與炎癥靶標(biāo)的共同生物進(jìn)程調(diào)控細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(cyclin-dependent kinase inhibitor，CDKN)轉(zhuǎn)錄與其心梗機(jī)制密切相關(guān)，在乏力、短氣證素表現(xiàn)中也較為明顯。該通路的支持文獻(xiàn)表明，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑對(duì)冠心病的易感性也有一定影響[24]，用模仿CDKN2A /2B基因作用的藥物進(jìn)行治療可能是一種延緩動(dòng)脈粥樣硬化的有前途療法[25]。此課題將繼續(xù)深入開(kāi)展對(duì)該通路的動(dòng)物、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，以期對(duì)心肌梗死氣虛血瘀證的進(jìn)一步揭示。