劉 婧，朱 鵬，鄭 婷，謝 千，郭斐斐，牛凡紅，王思農(nóng)

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730000)

痤瘡是一種毛囊皮脂腺的炎癥性疾病，好發(fā)于青少年，其患病率為82.9%，臨床表現(xiàn)為面頰部、胸背部的粉刺、炎性丘疹、結(jié)節(jié)、膿皰，易反復(fù)發(fā)作，遷延不愈，預(yù)后常遺留瘢痕影響患者的生活質(zhì)量[1，2]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)外用黃芩素治療模型大鼠耳廓復(fù)合痤瘡，對(duì)局部組織進(jìn)行HE染色觀察及ELISA法檢測(cè)組織中IL-4以及MMP-9的含量，以探究黃芩素干預(yù)痤瘡發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。該研究經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批準(zhǔn)編號(hào)2018-116。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雌雄各半的Wistar大鼠64只，體質(zhì)量(160±20)g，7～9月齡，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(甘)2015-0002。飼養(yǎng)于濕度45%～55%、溫度21 ℃～25 ℃的環(huán)境中，以標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料及無(wú)菌水飼養(yǎng)，動(dòng)物福利按照國(guó)際相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物法規(guī)實(shí)施。

1.2 藥物

黃芩素(批號(hào)ZY20190927)，由南京源植生物有限公司提供；凡士林(批號(hào)Q1402ALX172)，由山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司提供；50%油酸溶液(批號(hào)H20171201)，由無(wú)錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司提供；0.025%維A酸乳膏(批號(hào)H37023768)，由山東良福制藥有限公司；IL-4ELISA試劑盒(批號(hào)MM-0191R1)，由江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司提供；MMP-9ELISA試劑盒(批號(hào)MM-20918R1)，由江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司提供。

1.3 主要儀器

電子天平(蘇州坤宏電子有限公司，型號(hào)BMB124)；超低溫保存箱(海爾集團(tuán)，型號(hào)DW-25W518)；酶標(biāo)儀(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，型號(hào)SP-Max2300A2)；高速冷凍離心機(jī)(河南北弘儀器有限公司，型號(hào)TGL16 M)；電動(dòng)離心機(jī)(常州市光合有限公司，型號(hào)LD34)；顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，BA400Digital)。

1.4 方法

1.4.1 造模方法與分組 將64只雌雄各半的大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法抽取10只作為空白組，對(duì)剩余54只大鼠用kligman法建立右耳廓復(fù)合痤瘡模型[3]，即在大鼠右耳內(nèi)側(cè)面耳導(dǎo)管開(kāi)口處每日涂50%油酸溶液1次，每次0.5～1 mL，隔日于大鼠耳廓皮內(nèi)注射痤瘡丙酸桿菌菌液，連續(xù)3周。左耳不做任何處理，以作對(duì)比。待第22天時(shí)觀察大鼠耳廓皮損形態(tài)，右耳造模部位出現(xiàn)紅腫，皮溫升高，肉眼可見(jiàn)擴(kuò)張的毛細(xì)血管、毛孔增大、脫屑及丘疹樣隆起或囊腫，觸之皮損處粗糙干燥，并參考痤瘡模型判定分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[4]，提示復(fù)合痤瘡模型已形成。隨機(jī)抽取4只進(jìn)行病理切片觀察，病理提示造模成功后，將剩余50只大鼠隨機(jī)平均分為模型組、黃芩素高、中、低劑量組以及陽(yáng)性對(duì)照組。

1.4.2 給藥治療 分組完成后開(kāi)始給予造模處藥物治療，以凡士林為基質(zhì)將黃芩素混合于其中，根據(jù)人與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等效劑量換算得出：黃芩素低劑量組給予0.04 g生藥/cm2·d，中劑量組給予0.08 g生藥/cm2·d，高劑量組給予0.16 g生藥/cm2·d，陽(yáng)性對(duì)照組0.025%維A酸給予5 g/cm2·d，將藥物均勻地涂抹于痤瘡模型處，范圍約1 cm×1 cm，厚度約1 mm，每日給藥1次，給藥完成后固定于鼠板20 min，連續(xù)4周?？瞻捉M和模型組均不涂抹任何藥物。

1.5 形態(tài)學(xué)及組織學(xué)觀察

每日肉眼觀察并記錄大鼠耳廓造模處用藥前后皮損情況，末次用藥24 h后，大鼠經(jīng)3%的戊巴比妥麻醉后剪下一半右耳用HE染色處理，光鏡下觀察病理學(xué)組織形態(tài)，采集標(biāo)本后行頸椎脫臼法處死各組動(dòng)物。

1.6 細(xì)胞因子檢測(cè)

取剩余的一半右耳進(jìn)行皮膚組織勻漿細(xì)胞因子檢測(cè)，用預(yù)冷PBS溶液將大鼠右耳皮膚中的血液洗凈研碎后晾干放于EP管，加PBS勻漿(組織∶PBS體積比為1∶100)，離心后取上清液，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)IL-4、MMP-9的含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀察用藥后各組大鼠皮損變化

圖1示，空白組耳廓柔軟光滑，毛細(xì)血管清晰可見(jiàn)，模型組皮損處可見(jiàn)紅腫、脫屑及丘疹樣隆起或囊腫，毛細(xì)血管擴(kuò)張，觸之皮溫升高，粗糙干燥。陽(yáng)性對(duì)照組可見(jiàn)輕度紅腫，脫屑減輕，皮損部位溫度降低，毛細(xì)血管及毛孔稍有縮小。高劑量組可見(jiàn)皮損處恢復(fù)光滑柔軟，毛孔縮小，可見(jiàn)清晰的毛細(xì)血管，溫度與空白組基本一致，中劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組大致一致，皮損處紅腫減輕溫度降低，脫屑緩解，皮損處柔軟，低劑量較模型組改善效果不顯著。

注：a.空白組；b.模型組；c.陽(yáng)性對(duì)照組；d.低劑量組；e.中劑量組；f.高劑量組圖1 肉眼觀察用藥后各組大鼠皮損比較

2.2 病理學(xué)觀察各組大鼠用藥后右耳廓皮損變化

圖2示，光鏡下可見(jiàn)空白組耳廓厚度均一，皮下膠原纖維排列較為致密，毛囊及皮脂腺未見(jiàn)組織學(xué)改變，真皮及表皮界限清晰，脂肪組織清晰可見(jiàn)。模型組可見(jiàn)，表皮層增厚，角栓堵塞，毛囊增大，真皮層內(nèi)皮脂腺增生，皮下間質(zhì)內(nèi)形成明顯壞死灶，皮下組織內(nèi)炎性壞死灶形成，中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。陽(yáng)性對(duì)照組與中劑量表皮層厚度較為均一，角化物減少，炎性細(xì)胞及纖維壞死也較模型組減少。高劑量組表皮層較薄，炎性細(xì)胞基本消失，纖維組織減少。低劑量組表皮層較增厚，纖維組織增生，伴有中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。

注：a.空白組；b.模型組；c.陽(yáng)性對(duì)照組；d.低劑量組；e.中劑量組；f.高劑量組圖2 各組大鼠耳部組織炎癥改變比較(HE×100)

2.3 ELISA法檢測(cè)痤瘡模型大鼠局部組織中IL-4、MMP-9含量

表1示，模型組與空白組比較，IL-4、MMP-9含量顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；黃芩素低、中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠組織中IL-4、MMP-9的含量與模型組比較均有不同程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，各組含量趨勢(shì)為高劑量組<陽(yáng)性對(duì)照組<中劑量組<低劑量組。

表1 各組痤瘡模型大鼠局部組織中IL-4、MMP-9含量比較

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，痤瘡的發(fā)生與皮脂腺功能亢進(jìn)、毛囊角化過(guò)度、雄激素水平異常、痤瘡丙酸桿菌感染、炎癥相關(guān)[5]。特異性免疫反應(yīng)與痤瘡的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系密切，其中Th2細(xì)胞分泌的IL-4在免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用[6]，IL-4與痤瘡的嚴(yán)重程度呈正比，且臨床研究表明IL-4與患者的痤瘡瘢痕有密切聯(lián)系[7，8]。金屬蛋白酶(MMPs)屬于鋅依賴性內(nèi)肽酶，存在于細(xì)胞外基質(zhì)中。在痤瘡患者的皮損組織中，MMP-2、MMP-3 以及 MMP-9呈現(xiàn)高表達(dá)，MMPs的高表達(dá)可以加速皮膚膠原纖維的降解，最終導(dǎo)致瘢痕形成[9]。

《素問(wèn)·生氣通天論篇》曰：“勞汗當(dāng)風(fēng)，寒薄為皶，郁乃痤。”外邪、痰濕、血熱致玄府閉塞，郁火內(nèi)生，升降悖逆，氣液失運(yùn)，變生痰瘀，漸成結(jié)節(jié)，觸之腫硬疼痛或按之如囊[10]。黃芩性苦、寒，有清熱燥濕、安胎止血之效[11]，黃芩素是黃芩的主要成分之一，屬于5，6，7-三羥基黃酮，因其化學(xué)性質(zhì)活潑，水溶性較差[12]，故本實(shí)驗(yàn)以凡士林為基質(zhì)?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素可通過(guò)抑制iNOS、COX-2、NO、IL-6等因子的釋放，從而減輕炎癥[13]，或通過(guò)抑制髓樣分化因子-2(MD-2)/TLR4復(fù)合物的形成以及炎癥小體的激活，降低促炎介質(zhì)表達(dá)[14]。羅曉平等[15]發(fā)現(xiàn)，黃芩素能夠干預(yù)AKT/NF-κB通路磷酸化蛋白表達(dá)而抑制該通路激活，減少炎癥因子釋放。并可通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激CHOP/STAT途徑抑制細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子，對(duì)雙鏈RNA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞起到抗炎作用[16]。在體外細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，黃芩素可通過(guò)NF-κB和Wnt/b-catenin信號(hào)通路調(diào)控miR-9/IGF-1軸，抑制成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的產(chǎn)生，從而達(dá)到治療瘢痕的作用[17]，或作用于microRNA-29激活p38 MAPK-JNK通路，以延緩膠原的過(guò)度增殖和沉積，從而治療增生性瘢痕[18]。黃芩素亦可抑制MMP-2、MMP-9和組織蛋白酶來(lái)防止膠原降解[19]。此外黃芩素還具有抗菌[20]、抗氧化[21]、抗腫瘤作用[22]。紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)表明，黃芩素對(duì)眼睛無(wú)刺激性，對(duì)人體作用溫和[23]。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素可能通過(guò)降低痤瘡模型組織中IL-4、MMP-9的含量，進(jìn)而調(diào)控炎性介質(zhì)的發(fā)展并減少后期痤瘡瘢痕的形成。在臨床診療的過(guò)程中，西醫(yī)治療痤瘡容易反復(fù)，且存在使皮膚干燥、瘙癢、疼痛、色素沉著等副作用[24]。而中藥口感較差，有些患者不愿長(zhǎng)期服用。外用黃芩素治療痤瘡療效確切，在臨床中有較好的應(yīng)用前景。