張 堃，呂向坤，焦艾麗，丁雪蕾

先兆流產(chǎn)指妊娠28周期間出現(xiàn)的陰道流血、下腹痛或腰痛等癥狀，盆腔檢查宮口未開、胎膜完整、無妊娠物排出，若未及時治療，癥狀加重，可能發(fā)展為“難免流產(chǎn)”，甚至威脅到母親和胎兒的生命安全，是孕早期常見的并發(fā)癥，中醫(yī)學(xué)中“胎漏”“胎動不安”“滑胎”等屬于西醫(yī)先兆流產(chǎn)的范疇[1]。中醫(yī)治療先兆流產(chǎn)以安胎為主，固腎、養(yǎng)血、扶脾、益氣是基本治療方法[2]。槲皮素是一種天然植物源黃酮類化合物，是中藥桑寄生、菟絲子和杜仲等的主要成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒，抑制脂質(zhì)過氧化、血小板聚集及心臟保護等多種藥理作用[3，4]。桑寄生、菟絲子等作為保胎中藥復(fù)方中的君藥發(fā)揮作用，槲皮素作為其主要活性成分能否改善妊娠結(jié)局逐漸受到關(guān)注[5]。本研究擬通過建立先兆流產(chǎn)大鼠模型，探討槲皮素對先兆流產(chǎn)大鼠的保胎作用和對激素水平的影響及可能作用機制，為槲皮素相關(guān)藥物的研發(fā)和先兆流產(chǎn)的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級SD雌性未育大鼠55只，雄性大鼠25只(8周齡，體質(zhì)量雌性200～240 g，雄性280～300 g)，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0011。飼養(yǎng)環(huán)境：IVC獨立送風隔離籠雌雄分籠飼養(yǎng)，溫度20～25 ℃，相對濕度55%～65%，光照周期12 h，根據(jù)國家實驗動物管理條例進行喂養(yǎng)。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核批準。

1.1.2 藥品、主要試劑和儀器 槲皮素(純度98%)購自美國Sigma公司；α-氰基-(3，4-羥基)N-芐苯乙烯胺(AG490)購自美國Sigma公司；干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)、雌二醇、孕激素ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；β-人絨毛膜促性腺激素(β-human chorionic gonadotropin，β-HCG)ELISA試劑盒購自南京生興生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠Janus激酶2(Janus kinase2，JAK2)一抗、p-JAK2一抗、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription3，STAT3)一抗、p-STAT3一抗購自美國Thermo Fisher Scientific公司；兔抗鼠β-actin一抗購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔二抗購自英國Abcam公司；酶標儀購自美國Molecular Device公司；蛋白凝膠電泳儀購自上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 造模、分組及藥物干預(yù) 55只SD雌性大鼠灌胃2 mg/kg己烯雌酚一次促情以增加交配率，次日做陰道涂片檢查，根據(jù)動情期雌鼠陰道細胞變化特征選擇合格動情雌鼠，與雄鼠按2∶1比例合籠過夜交配，次晨制作陰道涂片觀察精子，發(fā)現(xiàn)大量精子為妊娠1 d。取50只妊娠大鼠按照隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、槲皮素組、AG490組、槲皮素+AG490組，每組10只。妊娠第1 天開始，槲皮素組、AG490組分別灌胃2.5 mg/ml槲皮素(生理鹽水配制)、3 mg/kg AG490(生理鹽水配制)，1次/d，連續(xù)7 d；槲皮素+AG490組先后灌胃2.5 mg/ml槲皮素和3 mg/kg AG490，1次/d，連續(xù)7 d；正常組、模型組實驗期間灌胃等量生理鹽水。除正常組外其余各組于妊娠8 d上午8時灌胃8.3 mg/kg米非司酮，下午6時灌胃100 μg/kg米索前列醇引發(fā)流產(chǎn)；正常組灌胃等量生理鹽水。妊娠9 d，槲皮素組、AG490組和槲皮素+AG490組分別給予2.5 mg/ml槲皮素、3 mg/kg AG490和2.5 mg/ml槲皮素+3 mg/kg AG490繼續(xù)灌胃4 d。

1.2.2 標本采集與處理 各組大鼠妊娠2周后稱體質(zhì)量，眼眶采血，3000 r/min(離心半徑8 cm)離心10 min，取上清置于-20 ℃冰箱備用。頸椎脫臼法處死大鼠，無菌解剖迅速摘取雙側(cè)卵巢和子宮，取出胚胎后稱重。部分子宮用Bouin液固定，后續(xù)進行HE染色，部分子宮用液氮快速冷凍，后續(xù)進行Western Bloting實驗。

1.2.3 ELISA檢測大鼠血清激素水平及免疫因子含量 酶標板設(shè)空白孔、標準品孔和樣品孔，標準品孔加梯度稀釋的不同濃度標準品，樣品孔加樣品稀釋液與樣品，混勻后封板，37 ℃孵育30 min，清洗液洗滌后拍干，除空白孔外其余各孔加50 μL酶標試劑，封板后37 ℃孵育1 h，洗滌后拍干，每孔加入100 μl顯色液，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色20 min，標準品孔出現(xiàn)顏色梯度變化時，加終止液終止反應(yīng)，以空白孔調(diào)零，450 nm波長測吸光度(OD)值，使用CurveExpert軟件以標準品濃度與OD值為變量繪制標準曲線，計算大鼠血清雌二醇、β-HCG和孕激素及免疫因子IFN-γ、TNF-α和IL-10的濃度。

1.2.4 檢測流產(chǎn)率和胚胎吸收率 觀察各組大鼠胚胎情況，發(fā)生死亡(吸收)胚胎的大鼠解剖時子宮呈現(xiàn)“竹節(jié)狀”，胚胎個體小，顏色呈黑褐色且部分出血壞死，沒有胎膜結(jié)構(gòu)。正常妊娠大鼠子宮內(nèi)未見瘀血，胚胎個體較大，顏色淡紅，胎膜完整且胎鼠輪廓清晰。按照下列公式計算雌鼠流產(chǎn)率和胚胎吸收率：流產(chǎn)率(%)=流產(chǎn)的雌鼠數(shù)/實驗組雌鼠總數(shù)×100%；胚胎吸收率(%)=被吸收的胚胎數(shù)/(被吸收的胚胎數(shù)+正常胚胎數(shù))×100%。

1.2.5 計算臟器系數(shù) 按照以下公式計算各組大鼠臟器系數(shù)：臟器系數(shù)=[子宮質(zhì)量(mg)+卵巢質(zhì)量(mg)]/體質(zhì)量(g)×10。

1.2.6 HE染色觀察大鼠子宮組織形態(tài)學(xué)變化 固定好的子宮組織脫水后石蠟包埋，切片(厚度4 μm)，二甲苯脫蠟，水化，蘇木精、伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠子宮組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.7 Western Blot檢測JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白的表達 取100 mg子宮組織，研磨后提取總蛋白，BCA法測樣品濃度，蛋白變性后上樣至10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別用JAK2(1∶500)、p-JAK2(1∶200)、STAT3(1∶500)、p-STAT3(1∶200)、β-actin(1∶1000)一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜10 min×3次，再用HRP標記二抗(1∶2000)室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，ECL化學(xué)發(fā)光液于暗室曝光顯影，對感光膠片條帶進行灰度分析，以目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度值的比值，作為目的蛋白相對表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清激素水平 大鼠血清雌二醇、β-HCG和孕激素水平組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與正常組比較，模型組血清雌二醇、β-HCG和孕激素水平降低(P<0.05)；與模型組比較，槲皮素組血清雌二醇、β-HCG和孕激素水平升高，AG490組血清雌二醇、β-HCG和孕激素水平降低(P<0.05)；與槲皮素組比較，槲皮素+AG490組血清雌二醇、β-HCG和孕激素水平降低(P<0.05)；與AG490組比較，槲皮素+AG490組血清血清雌二醇、β-HCG和孕激素水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 各組受孕大鼠血清雌二醇、β-HCG和孕激素水平比較

2.2 各組大鼠血清免疫因子含量 大鼠血清IFN-γ、TNF-α和IL-10水平組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與正常組比較，模型組血清IFN-γ、TNF-α水平升高，IL-10水平降低(P<0.05)；與模型組比較，槲皮素組血清IFN-γ、TNF-α水平降低，IL-10水平升高，AG490組血清IFN-γ、TNF-α水平升高，IL-10水平降低(P<0.05)；與槲皮素組比較，槲皮素+AG490組血清IFN-γ、TNF-α水平升高，IL-10水平降低(P<0.05)；與AG490組比較，槲皮素+AG490組血清IFN-γ、TNF-α水平降低，IL-10水平升高(P<0.05，表2)。

表2 各組大鼠血清IFN-γ、TNF-α和IL-10水平比較

2.3 各組大鼠流產(chǎn)率和胚胎吸收率 大鼠流產(chǎn)率、胚胎吸收率組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與正常組比較，模型組流產(chǎn)率、胚胎吸收率升高(P<0.05)；與模型組比較，槲皮素組流產(chǎn)率、胚胎吸收率降低(P<0.05)；與槲皮素組比較，AG490組流產(chǎn)率、胚胎吸收率升高，槲皮素+AG490組胚胎吸收率升高(P<0.05)；與AG490組比較，槲皮素+AG490組胚胎吸收率降低(P<0.05，表3)。

表3 各組大鼠流產(chǎn)率和胚胎吸收率 (n=10；%)

2.4 各組大鼠臟器系數(shù) 大鼠子宮、卵巢合重和臟器系數(shù)組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與正常組比較，模型組大鼠子宮、卵巢合重減小，臟器系數(shù)降低(P<0.05)；與模型組比較，槲皮素組大鼠子宮、卵巢合重增加，臟器系數(shù)升高，AG490組大鼠子宮、卵巢合重減小，臟器系數(shù)降低(P<0.05)；與槲皮素組比較，槲皮素+AG490組子宮、卵巢合重減小，臟器系數(shù)降低(P<0.05)；與AG490組比較，槲皮素+AG490組子宮、卵巢合重增加，臟器系數(shù)升高(P<0.05，表4)。

表4 各組大鼠臟器系數(shù)比較

2.5 各組大鼠子宮組織形態(tài)學(xué)變化 HE染色結(jié)果顯示，正常組妊娠大鼠子宮內(nèi)膜較厚，結(jié)節(jié)狀膨大，腺體、血管豐富，肌層正常；模型組子宮內(nèi)膜變薄，多數(shù)結(jié)節(jié)無膨大，腺體萎縮，似未孕大鼠子宮；槲皮素組子宮內(nèi)膜增厚，結(jié)節(jié)狀膨大，腺體數(shù)量增加，腺體萎縮明顯好轉(zhuǎn)；AG490組子宮內(nèi)膜較模型組變薄，無結(jié)節(jié)狀膨大，腺體數(shù)量減少，萎縮嚴重；槲皮素+AG490組子宮組織較AG490組子宮內(nèi)膜增厚，有結(jié)節(jié)狀膨大，腺體數(shù)量增加、萎縮減輕(圖1)。

圖1 各組大鼠子宮組織病理變化(HE，×200)A.正常組；B.模型組；C.槲皮素組；D.AG490組；E.槲皮素+AG490組

2.6 各組大鼠JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白表達水平 大鼠子宮組織p-JAK2、p-STAT3蛋白相對表達量組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與正常組比較，模型組p-JAK2、p-STAT3蛋白相對表達量降低(P<0.05)；與模型組比較，槲皮素組p-JAK2、p-STAT3蛋白相對表達量升高，AG490組p-JAK2、p-STAT3蛋白相對表達量降低(P<0.05)；與槲皮素組比較，槲皮素+AG490組p-JAK2、p-STAT3蛋白相對表達量降低(P<0.05)；與AG490組比較，槲皮素+AG490組血清p-JAK2、p-STAT3蛋白相對表達量升高(P<0.05)。各組大鼠子宮組織JAK2、STAT3蛋白相對表達量比較無明顯差異(表5，圖2)。

表5 各組大鼠JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白相對表達量比較

圖2 各組大鼠JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白表達AA.正常組；B.模型組；C.槲皮素組；D.AG490組；E.槲皮素+AG490組

3 討 論

先兆流產(chǎn)是妊娠最常見的并發(fā)癥之一，發(fā)病率為20%～25%，據(jù)統(tǒng)計約25%的患者最終發(fā)展為自然流產(chǎn)，嚴重影響婦女的身心健康[6，7]。先兆流產(chǎn)屬于多因素致病，包括母體因素、胚胎因素、不良習(xí)慣、內(nèi)分泌及免疫功能異常、生殖器官疾病(如子宮疾病和生殖道感染)、創(chuàng)傷刺激和環(huán)境等[8]。中醫(yī)認為腎虛、氣血虧虛和血瘀引起該病發(fā)生，部分患者因素有癥瘕以及既往墮胎史，離經(jīng)之血日久成瘀，致孕后瘀血不去，胎兒無法得到新血滋養(yǎng)導(dǎo)致流產(chǎn)[9]。西醫(yī)治療多以激素類藥物為主，不良反應(yīng)大，保胎成功率低，臨床效果不甚理想。中醫(yī)對其辯證分型為：腎虛型、血熱型、血虛型和血瘀型，相應(yīng)中藥治療方案為補腎填精、固沖安胎，補氣養(yǎng)血、固沖安胎，滋陰清熱、養(yǎng)血安胎和活血化瘀、固腎安胎，改善妊娠結(jié)局療效顯著，不良反應(yīng)少[10]。

槲皮素及其衍生物是天然植物化學(xué)物質(zhì)，廣泛存在于多種中藥、蔬菜和水果中，具有良好的生物活性[11]。近年研究顯示，槲皮素對心血管疾病、組織器官損傷及惡性腫瘤的防治效果良好[12，13]。Bolouki等[14]研究顯示，槲皮素對糖尿病妊娠小鼠子宮接受性標志物和胚泡著床率具有保護作用。Wang等[15]表明，槲皮素可以通過調(diào)控小鼠子宮內(nèi)膜細胞B淋巴細胞瘤-2基因/Bcl-2相關(guān)X蛋白凋亡相關(guān)蛋白的表達抑制子宮內(nèi)膜細胞凋亡并有利于胚胎植入。本研究建立先兆流產(chǎn)大鼠模型，經(jīng)槲皮素預(yù)處理及模型制備后繼續(xù)治療發(fā)現(xiàn)大鼠血清雌二醇、β-HCG、孕激素水平IL-10水平升高，血清IFN-γ和TNF-α水平、流產(chǎn)率、胚胎吸收率降低，卵巢、子宮合重增加，臟器系數(shù)升高；HE染色結(jié)果顯示，大鼠子宮內(nèi)膜增厚，結(jié)節(jié)狀膨大，腺體數(shù)量增加，腺體萎縮明顯好轉(zhuǎn)，提示槲皮素對先兆流產(chǎn)大鼠具有保胎作用，可提高其激素水平。

STAT3是一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活因子，參與包括細胞增殖、分化、遷移、凋亡及免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)過程[16，17]。STAT3主要由氨基端保守區(qū)、DNA結(jié)合區(qū)、轉(zhuǎn)錄激活區(qū)、SH2結(jié)構(gòu)域及絲/酪氨酸磷酸化位點等組成。胞外配體與細胞膜受體結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生改變，JAK2募集于受體胞漿側(cè)并發(fā)生磷酸化，STAT3通過SH2結(jié)構(gòu)域形成同源或異源二聚體，在JAK2激酶作用下，其C端酪氨酸殘基被磷酸化，并移位至細胞核，調(diào)節(jié)下游基因轉(zhuǎn)錄與表達，啟動一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。近年研究發(fā)現(xiàn)，子宮上皮STAT3控制子宮腔中狹縫狀結(jié)構(gòu)的形成，并且基質(zhì)STAT3抑制上皮雌激素反應(yīng)和細胞增殖，影響子宮的接受性和胚胎附著[18]。Yu等[19]發(fā)現(xiàn)，親環(huán)素A可通過調(diào)控STAT3通路促進小鼠胚胎植入。Fang等[20]發(fā)現(xiàn)，早期流產(chǎn)患者的流產(chǎn)組織(絨毛和蛻膜)中STAT3及其下游靶基因的表達顯著下調(diào)，體外AG490通過抑制STAT3信號通路抑制滋養(yǎng)層細胞的生長并促進其凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以顯著上調(diào)p-JAK2、p-STAT3蛋白表達激活JAK2/STAT3信號通路，通路抑制劑AG490呈相反作用效果，抑制劑和槲皮素同時處理后，抑制劑對通路相關(guān)蛋白表達的抑制作用被逆轉(zhuǎn)，提示槲皮素可能通過調(diào)控JAK2/STAT3信號通路對先兆流產(chǎn)大鼠的發(fā)揮保胎作用，提高激素水平。

綜上所述，槲皮素對先兆流產(chǎn)大鼠具有保胎作用，可提高其激素水平，作用機制可能與調(diào)控JAK2/STAT3信號通路有關(guān)，為槲皮素相關(guān)藥物的研發(fā)及先兆流產(chǎn)的臨床治療提供理論支持。