欒海龍， 王 錚， 王 寧， 孫豪君， 劉 斌， 韓文鋒,1

1.錦州醫(yī)科大學北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，遼寧 沈陽 110016；2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 骨科，遼寧 沈陽 110016

創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎(post traumatic osteoarthritis,PTOA)又稱外傷性關(guān)節(jié)炎，有別于老年人群好發(fā)的骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)，PTOA多好發(fā)于有明確外傷史、承重失衡及負重過度的年輕人群，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛及活動障礙[1-2]。近年來，發(fā)生交通事故、運動受傷、負重過度的患者明顯增多，關(guān)節(jié)軟骨的損傷情況更為多發(fā)且嚴重，PTOA的發(fā)病率有逐年上漲的趨勢[3]。國內(nèi)外學者一直將關(guān)節(jié)軟骨損傷視為PTOA病理變化的始動因素來研究[4]。PTOA的病理改變主要為關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)(extocellular matrix，ECM)降解，進而引起軟骨細胞凋亡，最終導致關(guān)節(jié)軟骨的丟失[5]，但其發(fā)病機制仍處于探索階段。血小板反應蛋白解整合素金屬肽酶(a disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS)家族在PTOA發(fā)病的始動環(huán)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，其中，ADAMTS-5在關(guān)節(jié)軟骨ECM的降解中研究的較為廣泛，然而其對細胞凋亡影響的分子機制尚有爭議[6-7]。本研究旨在通過分子生物學的手段分析該病的始動因素，進一步探索早期PTOA發(fā)生時軟骨細胞凋亡的分子機制，以期為臨床工作中早期預防及治療PTOA提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器 本研究小鼠由武漢康威達基因科技公司提供，體質(zhì)量約25～30 g。PMSF(100mM)、50×cooktail、磷酸化蛋白酶抑制劑、電致化學發(fā)光液、TWEEN 20、顯影定影試劑、Histone H3、HRP標記山羊抗小鼠、轉(zhuǎn)移緩沖液、TBS緩沖液(以上均有武漢賽維爾生物科技有限公司提供)，特級胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、氯胺酮、利多卡因、氯化鈉注射液、免疫組化試劑盒(以上均由北京雷根生物技術(shù)有限公司提供)，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)購自Hyclone，DMEM培養(yǎng)基購自Gibco。CO2恒溫培養(yǎng)箱(SANYO MCO-15AC)、生物倒置顯微鏡(重慶水電儀器總公司，XDS-18)、潔凈工作臺(蘇凈安泰SW-CJ-1FD)、離心機(Heal Force Neofuge 15R)、倒置熒光顯微鏡(Nikon TE2000)、酶標檢測儀(Rayto Rt2100c)。

1.2 研究方法

1.2.1 動物分組及建模 實驗組選取3只8周齡轉(zhuǎn)基因(敲除ADAMTS-5基因)雌性C57BL/6小鼠(n=3)，對照組選取3只8周齡普通雌性C57BL/6小鼠(n=3)。兩組小鼠腹腔注射氯胺酮(40 mg/kg)麻醉后，下肢前后位90°屈曲固定于定制的支架上(圖1a)。分別于術(shù)區(qū)(本研究統(tǒng)一選擇小鼠兩側(cè)后肢膝關(guān)節(jié))內(nèi)側(cè)間隙作一長約2 cm的弧形切口，離斷二分之一內(nèi)側(cè)副韌帶，小心打開關(guān)節(jié)腔，將髕骨推向外側(cè)的同時屈曲膝關(guān)節(jié)，顯露股骨髁，運用特制的光面不銹鋼楔形施壓端(Indenter)加壓(高度5～10 cm，0.5～1.0 kg)(圖1b)，碘伏、生理鹽水反復沖洗造模部位，最后用4號線逐層關(guān)閉切口。術(shù)后3 d肌肉注射青霉素200 000 U/d預防感染，本模型不作固定及其他外科干預，為加快兩組小鼠PTOA進程，每天爬坡訓練30 min。

圖1 關(guān)節(jié)內(nèi)骨折創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎模型構(gòu)建示意圖

1.2.2 觀察指標及測定 術(shù)后4周，將兩組小鼠脫頸處死，將小鼠膝關(guān)節(jié)置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h，10% 乙二胺四乙酸脫鈣，石蠟包埋后制成5 μm的切片備用。進行番紅O染色，最后由同一高年資病理科醫(yī)師根據(jù)各組標本病理組織學Mankin評分，對軟骨切片作定量分析以檢測軟骨損傷情況。

切片常規(guī)脫蠟脫水，PBS洗滌3 min，4%多聚甲醛固定60 min，PBS洗滌3 min后加入含0.1% 聚乙二醇辛基苯基醚的PBS溶液，冰浴孵育2 min。滴入預先配制的TUNEL檢測液，需充分混勻。PBS洗滌2次，然后加50 μl 的原位末端凋亡法檢測液，在37℃下避光孵育1 h，PBS洗滌3次后干燥、封片，熒光顯微鏡下觀察。

切片常規(guī)脫蠟脫水，3% H2O2中浸泡15 min，PBS沖洗5 min，胰蛋白酶消化液修復20 min，血清封閉后滴加一抗4℃過夜，PBS沖洗5 min 3 次，再滴加二抗，避光孵育30 min，PBS沖洗5 min 3次，使用封片液(含抗熒光淬滅劑)進行封閉處理，最后于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 ATDC5成軟骨細胞系慢病毒轉(zhuǎn)染和實驗分組 嘌呤霉素篩選：將細胞按30%匯合度接種到12孔板，將不同濃度嘌呤霉素(0～10 μg/ml)依次加入對應孔板，每日記錄細胞存活比例；本次ATDC5細胞系最小致死濃度2 μg/ml。慢病毒侵染目的細胞：轉(zhuǎn)染前24 h，取1×105個/孔的目的細胞接種于6孔板上，培養(yǎng)24 h后清除原來培養(yǎng)基，添加2 ml細胞完全培養(yǎng)基；置于37℃、5%濃度的CO2培養(yǎng)箱中，將細胞培養(yǎng)至匯合率40%～60%；再將病毒液于新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)8～12 h，若細胞無明顯病變則繼續(xù)培養(yǎng)，直至24 h后再次更換新鮮培養(yǎng)基，若細胞生長差可提前更換。加入2 μg/ml嘌呤霉素于細胞中培養(yǎng)，未感染病毒的細胞將被清除，純度、感染效率高的細胞便被篩選，繼續(xù)培養(yǎng)1～2周細胞不再凋亡，即細胞已經(jīng)穩(wěn)定表達目的基因。ADAMTS-5體外轉(zhuǎn)染ATDC5成軟骨細胞系，分為以下4組：干擾對照組、過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株組、過表達對照組、干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)株組。

1.2.4 MTT法檢測轉(zhuǎn)染的成軟骨細胞增殖 將轉(zhuǎn)染的細胞用胰蛋白酶消化，配制成細胞懸液，按每孔3 000～5 000個細胞接種在96孔板上，放置在5% CO2濃度、37℃環(huán)境的培養(yǎng)箱中培育過夜貼壁。按實驗方案進行加藥處理，每個樣本濃度設3～5個重復。在所有孔中分別滴入20 μl MTT比色液即5 mg/ml(0.5% MTT)，培養(yǎng)箱環(huán)境下孵育4 h；二甲基亞砜溶解甲臜，謹慎清除上清液，將150 μl二甲基亞砜均勻加入每孔，在120～140 r/min的震蕩床上緩慢震蕩10 min讓晶體物質(zhì)溶解充分；最后，使用酶標儀測定570 nm波長光的數(shù)值(A值)，計量細胞在該藥物下的抑制率。

抑制率=(A對照-A實驗)/A對照×100%

1.2.5 轉(zhuǎn)染的成軟骨細胞免疫熒光染色 PBS清洗3次爬片，4%的多聚甲醛固定液固定15 min，0.5%聚乙二醇辛基苯基醚室溫通透20 min，PBS清洗后添加山羊血清，室溫下封閉0.5 h；清除封閉液，加入一抗，4℃過夜； PBST(PBS液加入Tween-20)洗滌3次，加入二抗，室溫孵育1 h，PBST清洗，滴入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚后避光孵育5 min，PBST洗滌，封片液(含抗熒光淬滅劑)封閉后于熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 小鼠組織染色觀察 實驗組小鼠骨折處軟骨ECM明顯增多(圖2a)；對照組小鼠軟骨ECM含量較少(圖2b)。Mankin評分結(jié)果提示：實驗組小鼠的番紅O著色、軟骨結(jié)構(gòu)和潮線的完整性得分及Mankin評分總分均顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織Mankin評分比較評分/分)

圖2 四周后兩組小鼠膝關(guān)節(jié)番紅O染色結(jié)果(番紅O染色×20；a.對照組軟骨細胞丟失明顯，關(guān)節(jié)面可見少量軟骨細胞基質(zhì)；b.實驗組軟骨細胞含量較多，退化不明顯)

2.2 小鼠軟骨細胞凋亡觀察

2.2.1 TUNEL法染色結(jié)果 經(jīng)TUNEL法染色后，凋亡細胞在顯微鏡下顯示綠色熒光。對照組中綠色熒光染色較強，細胞核排列致密且濃染較多；實驗組幾乎沒有綠色熒光。見圖3。

圖3 兩組小鼠TUNEL法染色結(jié)果(TUNEL染色×5；a.對照組細胞核排列致密，綠色熒光染色較強TUNEL； b.實驗組僅見少量熒光)

2.2.2 免疫熒光染色結(jié)果 染色試劑將Caspase-9蛋白染成紅色，軟骨細胞核為藍色。實驗組Caspase-9蛋白的含量明顯低于對照組。見圖4。

圖4 兩組小鼠免疫熒光染色結(jié)果(免疫熒光染色×10;a.對照組caspase-9蛋白熒光染色較強，數(shù)量明顯增多；b.實驗組可見少量紅色的caspase-9蛋白)

2.3 MTT法檢測轉(zhuǎn)染細胞增殖 體外培養(yǎng)48 h后，4組細胞光密度值(optical density，OD)均較低，考慮為早期軟骨細胞潛伏期。第72 h時，4組OD值均有所增加，其中，干擾對照組增值幅度大，過表達對照組次之，兩組細胞生長旺盛；過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株組的OD值增幅最小，與過表達對照組相比差異顯著，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)株組與干擾對照組相比差異顯著，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。說明ADAMTS-5對小鼠軟骨細胞的增殖具有明顯的抑制作用。

表2 4組ATDC5細胞系細胞存活情況

2.4 轉(zhuǎn)染細胞免疫熒光染色

2.4.1 ADAMTS-5免疫熒光染色 干擾對照組的紅染熒光含量較少，過表達對照組在低倍鏡下可見少量紅染的ADAMTS-5蛋白，過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株組與干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)株組可見藍色的軟骨細胞周圍存在大量紅染的ADAMTS-5蛋白。見圖5。

圖5 免疫熒光技術(shù)檢測四組ATDC5細胞系ADAMTS-5蛋白表達情況(免疫熒光染色×20;a.干擾對照組；b.過表達對照組；c.干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)株組；d.過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株組)

2.4.2 Caspase-9蛋白免疫熒光染色 免疫熒光染色可見過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株組紅染的Caspase-9蛋白含量最高，干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)株組次之,過表達對照組及干擾對照組在電鏡下可見的紅染Caspase-9蛋白含量較少，干擾對照組紅染Caspase-9蛋白含量最少。見圖6。

圖6 免疫熒光技術(shù)檢測四組ATDC5細胞系caspase-9蛋白表達情況(免疫熒光染色×20;a.干擾對照組；b.過表達對照組；c.干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)株組；d.過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株組)

3 討論

PTOA多好發(fā)于有明確外傷史、承重失衡以及負重過度的年輕人群，以關(guān)節(jié)軟骨退化和軟骨ECM破壞為主要病理改變，影響生活質(zhì)量。由于患者年齡結(jié)構(gòu)偏向年輕化，如何延緩疾病進展、改善患者預后成為急待解決的臨床難題之一[11-12]。PTOA早期關(guān)節(jié)軟骨細胞體積增大且堆積成簇，形成“軟骨細胞集落”現(xiàn)象，盡管在此階段軟骨細胞增殖能力較強，關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中粘多糖的含量卻逐漸減少，故此期極易被誤會為早期軟骨細胞的正常代謝行為；當PTOA發(fā)展至晚期時，軟骨細胞凋亡，導致軟骨細胞大幅減少和陷窩空缺形成[13-14]。與OA緩慢發(fā)展的特點不同，細胞凋亡的過程較快，故軟骨細胞凋亡中ECM的降解也較為迅速，因此，單純這一作用機制無法全面概括軟骨細胞凋亡。

真核細胞通常可以經(jīng)過和相鄰細胞接觸或游離于ECM而存在，故被稱為“錨定依賴性”，OA會損傷ECM中膠原網(wǎng)絡與蛋白多糖的結(jié)構(gòu)，促進軟骨細胞凋亡。細胞凋亡時，溶酶體酶大量釋放，且與凋亡小體的吞噬作用關(guān)系密切。而有別于該種凋亡通路，軟骨細胞凋亡時，細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體及溶酶體的增殖，產(chǎn)生眾多自噬性空泡及細胞成分進入腔隙中[15-16]。有研究表明，在ECM降解與軟骨細胞凋亡的過程中，很難確定兩者的原發(fā)與繼發(fā)關(guān)系[17]。當軟骨細胞凋亡被抑制時(即ADAMTS-5基因的抑制)可明顯抑制軟骨ECM的降解，故可認為，軟骨細胞的凋亡和ECM的降解是一個相互促進的正向循環(huán)。

膝關(guān)節(jié)的主要著力部位在股骨內(nèi)側(cè)髁與內(nèi)側(cè)脛骨平臺關(guān)節(jié)面，該處關(guān)節(jié)軟骨的退變最能代表PTOA的病理變化[18-19]，本研究選取該處進行分析。番紅素O能與ECM中的蛋白多糖特異性結(jié)合，ECM中蛋白聚糖的含量能通過其染色的深淺直觀表現(xiàn)出來，再根據(jù)Mankin評分系統(tǒng)以及利用TUNEL法、免疫熒光染色檢測軟骨細胞及Caspase-9蛋白凋亡情況，進而評價ADAMTS-5基因?qū)TOA小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨凋亡的影響。本研究中，當小鼠ADAMTS-5基因表達被抑制時，小鼠PTOA早期軟骨細胞凋亡進程明顯變緩。筆者認為，ADAMTS-5可以促進軟骨細胞凋亡，但ADAMTS-5影響PTOA早期發(fā)病的分子機制仍需進一步討論。

目前，PTOA的發(fā)病機制普遍接受的學說有細胞因子學說、自由基學說、金屬蛋白酶學說及骨內(nèi)壓增高學說等[20-22]。軟骨組織由軟骨細胞與ECM組成，ECM在力學中有重要的緩沖作用，在生物學中則是軟骨細胞賴以生存的內(nèi)環(huán)境，ECM的合成與降解正常狀態(tài)下處于相對穩(wěn)定的動態(tài)平衡，ECM的生成與降解失衡是引起OA的重要原因，這與主流金屬蛋白酶學說的理念較為契合[23]。金屬蛋白酶學說認為，ADAMTS家族在ECM的降解過程中扮演著重要作用，ADAMTS-5作為聚蛋白多糖降解的重要酶類，在研究ECM中聚蛋白多糖的降解具有重要價值[24]。有學者敲除ADAMTS-5基因后構(gòu)建關(guān)節(jié)失穩(wěn)小鼠模型，分別作血液學分析與組織形態(tài)的比較，提示敲除ADAMTS-5基因可延緩甚至暫停軟骨組織的損害[25]。Hoshi等[26]將ADAMTS-5的小干擾RNA注射在骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型的關(guān)節(jié)腔內(nèi)，當ADAMTS-5基因表達被抑制后大鼠關(guān)節(jié)軟骨退變進程減緩，研究得出在關(guān)節(jié)軟骨退變過程中，ADAMTS-5扮演重要角色。有學者特異性阻斷人軟骨細胞ADAMTS-5基因的siRNA轉(zhuǎn)錄，發(fā)現(xiàn)當ADAMTS-5基因表達被阻斷時，能有效避免軟骨組織發(fā)生退變[27]。上述研究結(jié)果提示，ADAMTS-5在ECM的降解過程中起著重要作用。

Caspase家族是誘發(fā)軟骨細胞發(fā)生凋亡的關(guān)鍵酶。Caspase-9蛋白更是這一生理變化的啟動子。因此，該蛋白的含量常被用作檢測細胞凋亡的程度[28-29]。實驗二免疫熒光染色法中，過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株組與干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)株組中藍色的軟骨細胞周圍存在大量紅染的ADAMTS-5及Caspase-9蛋白，過表達對照組及干擾對照組視野中的紅染蛋白含量顯著減少，這與MTT結(jié)果相互印證，共同說明ADAMTS-5基因在過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株組與干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)株組中顯著表達，在過表達對照組及干擾對照組中幾乎不表達，且隨著ADAMTS-5基因的表達，Caspase-9蛋白的含量逐漸增加，最終促使軟骨細胞發(fā)生凋亡。PTOA是一種發(fā)生在全關(guān)節(jié)的慢性退行性疾病，組織學的改變除軟骨退變外還有軟骨下骨硬化以及滑膜肥厚纖維化等[30]。對于PTOA疾病進程中所涉及的其他靶點組織的有關(guān)作用在本實驗并未研究，尚需進一步研究發(fā)現(xiàn)。

綜上所述，ADAMTS-5基因可通過調(diào)控Caspase-9蛋白的含量，加速ECM中蛋白聚糖的降解，抑制該基因的表達可有效延緩PTOA的進展，為臨床預防、治療PTOA提供一種新的思路。