弘子姍，王君毅，劉俊佑，龔加順

(云南農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術學院,云南 昆明 650201)

楓香樹(Liquidambar formosanaHance)又名楓樹、大葉楓、黑飯木，是金縷梅科楓香屬落葉喬木[1-2]。楓香性平，味辛、苦，具有祛風除濕、行氣止痛和解毒之功效[3]。楓香常被民間用作食物著色的色素原料[4]，用其汁液染制糯米，蒸出的米飯烏黑發(fā)亮，味道誘人，是云南和貴州等地少數(shù)民族的特色食品“五彩飯”之一[5]。楓香樹葉黑色素是一種多酚類物質(zhì)[6-7]，具有抗氧化[8-9]、抗衰老[10]、抗病毒[11]、抗炎[12-13]、降血壓[14]和抗過敏[15]等生物活性。

針對植物天然色素提取及其抗氧化活性的研究很多，如鄒青飛等[16]和黃建蓉等[17]對不同植物色素的提取工藝及抗氧化活性進行了研究；也有針對楓香黑色素的研究，如張莉等[18]研究得出楓香樹葉黑色素的最佳提取工藝條件為60%提取劑質(zhì)量分數(shù)、微波功率700 W、料液比為1∶30、提取時間55 s；謝宇奇等[19]對楓香樹葉黑色素進行研究發(fā)現(xiàn)其具有一定的清除DPPH自由基能力，且清除能力大于二丁基羥基甲苯 (BHT)。但目前在天然色素對糯米染色方面的研究極少，特別是針對地方特色“五彩飯”中楓香色素對糯米的染色作用研究鮮見報道。楓香色素染制大米，除賦予大米天然色澤外，染色后的米可能具有抗氧化活性等功能，這可能是少數(shù)民族熱衷于利用天然植物制作“五彩飯”的主要原因之一。徐塬等[20-22]對烏飯樹葉色素對大米蛋白和淀粉的相互作用進行研究，認為烏飯樹葉色素與大米蛋白之間以疏水作用和氫鍵作用進行結合，因此，理論上認為楓香色素與糯米淀粉和蛋白質(zhì)等的相互作用存在類似情況。

本研究以云南產(chǎn)的人工種植楓香樹葉為原料，采用單因素和響應面優(yōu)化設計，對楓香黑色素進行提取工藝優(yōu)化；通過體外抗氧化試驗，評價楓香提取物和糯米在染色前后的抗氧化活性變化；以氣味、外觀結構、適口性、滋味和冷飯質(zhì)地等為評價指標，對楓香黑米飯感官品質(zhì)進行綜合比較；通過掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)初步研究優(yōu)化提取的色素對糯米的染色表觀性能。綜合以上結果以期獲得楓香色素最佳提取工藝，明確染色糯米的抗氧化活性，初步揭示楓香色素染色糯米的作用，為楓香染制糯米的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和楓香色素的開發(fā)利用提供理論依據(jù)，為少數(shù)民族特色食品“五彩飯”的開發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

楓香樹葉：采自云南省曲靖市師宗縣人工栽培的楓香，楓香鮮葉于30 ℃低溫干燥，避光于室溫儲存?zhèn)溆?。糯米?019年產(chǎn)自云南昆明，購于云南滇鵬產(chǎn)業(yè)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 單因素試驗

參照謝宇奇等[23]的研究結果，以60%乙醇溶液為提取溶劑，以270 nm處的吸光度為指標，考察提取時間 (1～8 h)、提取溫度 (30～70 ℃)和料液比 [1∶25～1∶50 (g/mL)]等3個因素對提取效果的影響，確定最佳工藝的因素水平。

1.2.2 響應面優(yōu)化試驗設計

采用響應面優(yōu)化試驗設計 (表1)對楓香黑色素的提取工藝進行優(yōu)化。

表1 響應面試驗因素與水平設計Tab.1 Independent variables and their levels used in response surface analysis

1.2.3 楓香黑米飯制作及其感官評價

(1) 樣品制備

參考傳統(tǒng)民間植物染飯工藝，經(jīng)多次試驗確定楓香黑米飯的制作流程。按照確定的最優(yōu)色素提取工藝提取色素溶液(即染料)，將染料加熱至60 ℃，稱取原料糯米，淘洗干凈后倒入染料于室溫下浸泡染色30 min，倒出米，將染料加熱至60 ℃，再次倒入米浸泡染色，重復3次后將米濾干，于100 ℃蒸制15 min，以備感官評價。

(2) 楓香黑米飯感官評價

楓香黑米飯及對照白米飯感官評價參照GB/T 15682—2008進行并略作修改，由氣味(20分)、外觀結構(30分)、適口性(25分)、滋味(20分)和冷飯質(zhì)地(5分)等5個部分組成，分別設立評分標準，以有效地對楓香黑米飯產(chǎn)品感官品質(zhì)進行綜合評比。每組產(chǎn)品由10位品評員評分，并以平均分作為產(chǎn)品的最終得分。

1.2.4 楓香黑糯米的微觀形貌分析

樣品制備同1.2.3節(jié)。觀察未染色生糯米和糊化糯米及楓香樹葉黑色素染色生糯米和糊化糯米的微觀結構。用刀片將糯米橫向切斷，米粒的斷面朝上，用離子衍射儀 (Cressington 108，英國)在糯米橫斷面表面進行噴金和固定。色素粉末均勻地分散在樣品處理臺上，采用S-4800 SEM在10.0 kV工作電壓下分別放大200、5 000和10 000倍觀察并記錄。

1.2.5 楓香黑糯米的抗氧化活性評價[24-27]

樣品制備同1.2.3節(jié)。以Trolox 作為標準品繪制標準曲線并建立回歸方程，DPPH自由基清除能力回歸方程為：y=0.055x+8.636，R2=0.995；ABTS自由基清除能力回歸方程為：y=0.136x+24.664，R2=0.993；鐵離子還原能力(FRAP)回歸方程為：y=0.004x+0.098，R2=0.991；氧自由基吸收能力(ORAC)回歸方程為：y=0.421x+7.477，R2=0.998。根據(jù)標準曲線計算樣品的抗氧化活性，結果以每克樣品所需Torlox 的量表示 (μmol/g)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理；利用SPSS 19.0 進行方差分析和顯著性分析；采用Design-Expert 8.0.6 進行響應面分析；采用Origin 9.1和Graphpad Prism 6.01作圖。所有試驗重復3 次以上，結果以平均值表示。

2 結果與分析

2.1 不同提取條件對楓香樹葉黑色素提取效果的影響

由圖1可知：楓香黑色素提取效果隨料液比、提取溫度和提取時間的增加而均呈先增加后降低的變化趨勢。當料液比達到1∶40 (g/mL)時提取效果最好，且與其他料液比相比差異顯著(P<0.05)；當提取溫度達到60 ℃時提取效果最好，且與其他提取溫度相比差異顯著(P<0.05)；當提取時間達到6 h時提取效果最好，且與除提取時間7 h外的其他提取時間相比差異顯著(P<0.05)。

圖1 不同提取條件對色素提取效果的影響Fig.1 Effect of extraction factors on the yield of pigments

2.2 響應面優(yōu)化楓香樹葉黑色素提取工藝

2.2.1 響應面試驗設計結果

通過Design-Expert 8.0.6 軟件對表2進行多元回歸擬合，得到吸光度與提取時間(X1)、提取溫度(X2)、料液比(X3)的二次方程模型為：Y=0.073 8+0.467 3X1-0.037 1X3+0.000 6X1X2-0.001 0X1X3+0.000 2X2X3-0.039 7X12-0.000 1X22+0.000 4X32。回歸模型的方差分析結果見表3。

表2 響應面分析結果Tab.2 Experimental design and results of response surface analysis

由表3可知：模型中一次項X1對色素提取效果達到極顯著水平(P<0.01)，X2對色素提取效果達到顯著水平(P<0.05)；模型中交互項X2X3對色素提取效果達到極顯著水平(P<0.01)，X1X3對色素提取效果達到顯著水平(P<0.05)；模型中二次項X12和X32對色素提取效果達到極顯著水平(P<0.01)。楓香黑色素提取工藝回歸模型顯著性檢驗P<0.000 1，說明該模型達到極顯著水平；楓香黑色素提取工藝回歸模型失擬項檢驗=0.386 9>0.05，可以認為所選提取二次回歸模型與實際試驗擬合性充分模型失擬不顯著。試驗模型決定系數(shù)R2=0.978 6，表明方程的擬合度良好，可用于預測楓香黑色素提取效果。離散系數(shù)(CV值)為1.014 6%，表明試驗的可靠性較高。綜上所述，回歸模型擬合程度良好，試驗誤差小，能夠準確的分析和預測楓香黑色素提取工藝，說明試驗操作可信度高。由回歸系數(shù)顯著性表明：在所取因素水平范圍內(nèi)，各因素對楓香黑色素提取工藝影響的順序為：提取時間>提取溫度>料液比。

表3 楓香黑色素提取效果回歸模型方差分析表Tab.3 Analysis of variance analysis of degree of the effect of pigments

2.2.2 最佳條件的確定和回歸模型的驗證

響應面圖中越陡峭顯示該因素對其影響越明顯，反之，越平坦則影響不明顯[28]。由圖2a、2b可知：提取時間和提取溫度交互作用的等高線圖呈圓形，響應面曲面坡度較平緩，表示兩因素交互作用不顯著；而圖2c、2d中提取時間和料液比、圖2e、2f中提取溫度和料液比交互作用的等高線圖和響應面曲面呈馬鞍形，表示兩因素交互作用顯著[29]。在提取溫度和料液比交互作用的等高線圖中，等高線沿料液比的增加方向密集、降低方向稀疏，說明增加料液比會更顯著地影響色素提取效果。同理，增加提取時間會更顯著地影響色素提取效果。

圖2 各兩因素交互作用對色素提取率的響應面Fig.2 The response surface interaction of various factors to the yield of pigments

二次回歸模型擬合結果顯示：提取時間5.74 h、提取溫度69.55 ℃、料液比1∶49.98 (g/mL)時預測吸光度為0.766 3。為了驗證模型的有效性并考慮到實際情況，將最佳工藝條件改進為提取時間6 h、提取溫度70 ℃、料液比1∶50 (g/mL)，并在此條件下的6 次重復試驗結果表明吸光度為0.734，與預測值接近，說明模型準確可靠。

2.3 楓香黑米飯的抗氧化活性評價

由圖3可知：楓香染料具有較強的抗氧化活性，隨著染色時間的增加，其抗氧化活性逐漸降低，其DPPH、ABTS、FRAP和ORAC活性顯著降低(P<0.001)，而糯米經(jīng)染色后其抗氧化活性極顯著增加(P<0.001)。此外，空白組(空白水溶液、白糯米)的ABTS、FRAP和ORAC變化均無顯著性差異(P>0.05)。因此，糯米在染色后可以從楓香黑色素中得到較強的抗氧化能力，且差異極顯著(P<0.001)。

圖3 樣品的抗氧化活性Fig.3 Antioxidant activity of samples

2.4 楓香黑米飯感官評價及其微觀形貌分析

2.4.1 楓香黑米飯染色感官評價

由表4可知：染色糯米飯的氣味和滋味、彈性和粘性以及總體評分均顯著低于白米飯 (P<0.05)。

表4 米飯感官評定結果Tab.4 Results of sensory evaluation for rice

2.4.2 楓香黑米飯的SEM分析

(1) 楓香黑色素微觀形貌

在SEM掃描電鏡下觀察楓香黑色素的形貌如圖4所示：楓香黑色素顆粒不規(guī)則且多樣，呈現(xiàn)棉絮狀、扁片狀等。

圖4 楓香黑色素顆粒微觀結構(10 000×)Fig.4 Microstructure of melanin from Liquidambar formosana

(2) 生糯米染色前后微觀形貌變化

未染色糯米(簡稱“白糯米”)和楓香樹葉黑色素染色糯米(簡稱“黑糯米”)的微觀形態(tài)見圖5。由圖5c可以明顯看出胚乳細胞顆粒表面有碎屑，可能是淀粉粒與色素發(fā)生相互作用所致。由圖5b、5d可看出：淀粉粒表面由光滑變成皺縮、凹凸不平、粗糙且不均勻，且淀粉粒尺寸明顯增大。

圖5 染色前后生糯米胚乳細胞表面微觀結構Fig.5 Microstructure of albuminous cells of raw glutinous rice before and after dyeing

(3) 糊化糯米染色前后微觀形貌變化

糊化白糯米和糊化黑糯米的微觀形態(tài)見圖6。由圖6c可看出：糯米胚乳細胞結構仍處于完整未分解狀態(tài)，而圖6a無胚乳細胞結構，說明相同處理條件的白糯米糊化度明顯高于黑糯米，因此可以推斷色素對淀粉粒的附著包埋會降低糯米粒的吸水作用，阻礙淀粉分子散開，減慢糊化進程。由圖6d可以看出：黑糯米的淀粉粒糊化是混亂無序的，糯米胚乳細胞截面孔洞大小不一，裂縫為撕裂形態(tài)，與白糯米形成整齊的網(wǎng)絡狀結構完全不同。

圖6 染色前后糊化糯米胚乳細胞表面微觀結構Fig.6 Microstructure of albuminous cells of gelatinized glutinous rice before and after dyeing

3 討論

楓香黑色素作為天然色素具有廣闊的開發(fā)利用前景。ZHANG等[30]研究發(fā)現(xiàn)：楓香樹葉提取物中含有豐富的酚類和單寧物質(zhì)，其DPPH和ABTS自由基清除能力分別為IC5012.04 μg/mL和IC5017.11 μg/mL；WANG等[31]對楓香葉提取物進行抗氧化性研究發(fā)現(xiàn)：所有提取物均有較高的抗氧化活性，且抗氧化活性強弱為：乙醇提取物>水提物>丙酮提取物。本研究表明：楓香黑色素具有較強的抗氧化活性，其對DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、Fe3+還原能力和氧自由基吸收能力分別為(798.516±13.544)、(494.664±0.957)、(993.000±20.418)和(2 202.293±51.375) μmol/g，與上述研究結果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)：糯米經(jīng)染色后，其抗氧化能力隨著染色時間的增加而極顯著增加 (P<0.001)，楓香色素染制糯米不僅對糯米賦色，還賦予糯米抗氧化功效。少數(shù)民族“五彩飯”中其他顏色可能存在類似功效，還需進行后續(xù)研究。

楓香黑米飯感官評價結果表明：糯米經(jīng)楓香染色后，對糯米飯的感官品質(zhì)有一定影響，其感官評分與白糯米飯相比顯著下降 (P<0.05)，特別是氣味和滋味，需要進一步改進。原因可能是楓香植物中具有獨特的氣味物質(zhì)成分，部分人不能接受其氣味和風味。因此，對楓香黑米飯染色工藝進行優(yōu)化，特別是對染色糯米飯風味物質(zhì)的研究尤其重要，染色米飯中影響感官品質(zhì)氣味和滋味的問題亟待解決。本研究還發(fā)現(xiàn)：染色米飯的粘性和彈性也顯著下降(P<0.05)，且染色米飯的糊化程度明顯較白米飯低，表明多酚類物質(zhì)與淀粉的結合會顯著降低淀粉的糊化及消化[32-34]。楓香黑色素的吸附導致黑糯米在相同處理條件下的糊化度較低，從而影響其粘性和彈性，因此，后續(xù)研究需考慮如何避免此情況引起的染色糯米飯感官品質(zhì)下降。

前人主要通過多酚或黃酮類物質(zhì)與淀粉或蛋白之間的相互作用對天然色素進行研究。徐塬等[20-22]對烏飯樹葉色素對大米蛋白和淀粉的相互作用進行研究，認為烏飯樹葉色素與大米蛋白之間以疏水作用和氫鍵作用進行結合。劉立增等[35]研究發(fā)現(xiàn)：羥基紅曲紅色素分子與淀粉顆粒間的吸附是以氫鍵為主的物理吸附。AMOAKO等[36]研究發(fā)現(xiàn)：直鏈淀粉和聚合原花青素之間形成II型半結晶V型包合物。TAKAHAMA等[37]在研究淀粉與花青素—兒茶素色素的相互作用中發(fā)現(xiàn)：淀粉與多酚絡合物的疏水作用可能會抑制淀粉消化。楓香黑色素屬于多酚類物質(zhì)，其對糯米的染色與糯米淀粉和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的相互作用存在類似情況，但目前針對“五彩飯”中楓香色素對糯米的染色作用研究鮮見報道。本研究用楓香對糯米進行染色，通過觀察其微觀結構確定其與色素發(fā)生了相互作用，為后期與淀粉和蛋白互作的研究提供了基礎。掃描電鏡發(fā)現(xiàn)：經(jīng)染色后糯米淀粉粒由表面光滑變?yōu)榘櫩s、凹凸不平、粗糙且不均勻，在同一放大倍數(shù)下，糯米胚乳細胞中淀粉粒粒徑明顯增大，這一現(xiàn)象與劉立增等[35]的研究結果一致。同時，還發(fā)現(xiàn)色素吸附會影響淀粉的糊化，糊化程度降低，導致淀粉粒糊化狀態(tài)由三維網(wǎng)絡狀結構變?yōu)榛靵y無序的撕裂狀態(tài)，原因可能是色素的吸附影響了蒸制過程中淀粉的吸水作用，阻礙淀粉分子散開，使糊化進程減慢，但在此過程中分子是如何推動這些現(xiàn)象的發(fā)生亟待深入研究。

4 結論

提取楓香黑色素的最佳提取工藝為提取溫度70 ℃、提取時間6 h、料液比1∶50 (g/mL)，此條件下楓香黑色素的吸光度可達0.734。楓香黑色素具有較強的抗氧化活性，糯米在染色后可以從楓香黑色素中獲得較強的抗氧化性。染色對糯米的感官品質(zhì)有一定影響，特別是氣味和滋味。糯米淀粉粒與色素發(fā)生相互作用，導致淀粉粒形態(tài)改變，尺寸增大，染色后糯米糊化度降低。