宗亞倩，魯洪智，段新慧，周 凱，單貴蓮，何承剛 ，姜 華

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細(xì)菌的總稱[1-2]。乳酸菌用途廣泛，在釀酒、奶制品加工和藥品等行業(yè)都起著重要作用；同時，也是飼料青貯成功的關(guān)鍵物質(zhì)[3]。它產(chǎn)酸能力強，能將飼料中的可溶性糖轉(zhuǎn)化成乳酸，抑制不良發(fā)酵，更好地保存飼料中的營養(yǎng)成分[4]。

在養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展的大環(huán)境下，青貯玉米既可滿足飼草料的需求又能緩解中國糧食供需矛盾，是解決畜牧業(yè)發(fā)展與青貯飼料供給不足的有效途徑[5]。青貯飼料中微生物的種類會隨青貯環(huán)境和發(fā)酵條件的不同而有顯著差異[6]，因此，學(xué)者們針對不同地區(qū)的青貯玉米進(jìn)行了乳酸菌的分離及篩選。胡勇等[7]從青海省青貯玉米中分離得到的乳酸菌主要是帕氏乳桿菌(Lactobacillus parafarraginis)和希氏乳桿菌(Lactobacillus higardii)；趙子夫[8]從內(nèi)蒙古不同地區(qū)青貯玉米中篩選的2株乳酸菌分別為消化乳桿菌(Lactobacillus alimentarius)和果糖乳桿菌(Lactobacillus fructosus)；吳書奇等[3]從南疆青貯玉米中分離的乳酸菌分別為葡萄球菌屬(Staphylococcus)和芽孢桿菌屬(Bacillu)?？梢姡煌貐^(qū)青貯玉米中乳酸菌的種類不盡相同，而對于云南地區(qū)青貯玉米中乳酸菌的分離及鑒定鮮有報道。因此，本研究以云南省龍陵縣種植的全株青貯玉米為材料，通過形態(tài)特征、生理指標(biāo)分析及16S rDNA序列分析等方法篩選優(yōu)質(zhì)乳酸菌，以期為青貯乳酸菌接種劑的研發(fā)奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在乳熟期全株收割大天1號青貯玉米，用鍘刀鍘至段長2～3 cm，充分混合均勻后，裝入青貯袋，每袋20 kg，密封，設(shè)置3次重復(fù)，于60 d后開袋取樣。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離和純化

取10 g青貯樣品，加入90 mL滅菌生理鹽水中，置于搖床上振蕩1 h后，用無菌生理鹽水稀釋，取稀釋度為10-4，10-5和10-63個梯度的稀釋液各0.5 mL均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)36 h。挑選長勢比較好的單個菌落進(jìn)行分離純化。參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9]對菌株進(jìn)行初篩。

1.2.2 乳酸菌的產(chǎn)酸測試

初篩得到的菌株過夜培養(yǎng)，按5%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，測定其pH值。

1.2.3 乳酸菌的生長曲線繪制

初篩得到的菌株過夜培養(yǎng)，按5%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)中，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，每隔4 h取1次發(fā)酵液，在波長600 nm下測定樣品的吸光度值(OD值)，以培養(yǎng)液為空白對照，繪制生長曲線。

1.2.4 乳酸菌的16S rDNA基因序列測定

采用的細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒購自上海生工(產(chǎn)品編號：B518225)，參照產(chǎn)品說明書對菌株培養(yǎng)液進(jìn)行DNA提取。以細(xì)菌基因組DNA為模板，以27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-AAGTCGTAACAAGGTAACC-3′為擴增引物序列進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)體系為：10 μmol/L引物1.0 μL；10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，Taq酶0.3 μL，模板1.0 μL，加超純水至25.0 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。得到的PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。將提取的乳酸菌基因組DNA送往上海生工生物有限公司測序，利用NCBI檢索系統(tǒng)在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的形態(tài)學(xué)特性

從青貯樣品中分離得到7株乳酸菌，命名為Z1～Z7，其形態(tài)特征如表1所示。7株菌株均為白色，有凸起，表面濕潤，菌落形狀均為圓形。其中，Z1、Z6及Z7菌落較大；Z4和Z5為中等大小，有鈣圈；Z2和Z3菌落最小且有鈣圈。7株菌株革蘭氏染色均為陽性，過氧化氫觸酶試驗均為陰性，初步鑒定為乳酸菌。

表1 菌落形態(tài)學(xué)特性Tab.1 Colony morphology of lactic acid bacteria strians

2.2 乳酸菌的產(chǎn)酸能力

由表2可知：培養(yǎng)4 h時，各菌株的pH值均下降，其中Z2菌株的pH值顯著高于Z3菌株(P<0.05)，其他菌株間差異不顯著(P>0.05)；培養(yǎng)8 h時，Z2菌株的pH值顯著高于Z1、Z3和Z7菌株(P<0.05)；培養(yǎng)12 h時，Z2和Z4菌株的pH值顯著高于Z3和Z7菌株(P<0.05)；培養(yǎng)24 h時，Z2菌株的pH值顯著高于其他菌株(P<0.05)，Z4菌株的pH顯著高于除Z2菌株以外的其他菌株(P<0.05)；培養(yǎng)36 h時，Z2和Z4菌株的pH值顯著高于其他菌株(P<0.05)。隨著培養(yǎng)時間的延長，各菌株的pH值均在培養(yǎng)12 h內(nèi)顯著下降(P<0.05)；培養(yǎng)24 h時，只有Z1和Z2菌株的pH值仍然顯著下降(P<0.05)；培養(yǎng)36 h時，各菌株的pH值變化不顯著(P>0.05)。總體看來，Z2和Z4菌株產(chǎn)酸能力較弱，Z1、Z3、Z5、Z6和Z7菌株產(chǎn)酸能力較強。

表2 培養(yǎng)時間對乳酸菌pH值的影響Tab.2 Effect of culture time on the pH of lactic acid bacteria

2.3 乳酸菌的生長曲線

由圖1可知：7株乳酸菌中，Z1、Z3和Z7菌株可以快速進(jìn)入對數(shù)生長期，適應(yīng)性強，適應(yīng)周期短，4～8 h進(jìn)入生長期，生長速度最快，8～12 h進(jìn)入穩(wěn)定期，之后生長速度緩慢，在發(fā)酵過程中沒有出現(xiàn)明顯的衰退期。Z1、Z3和Z7菌株的OD值分別達(dá)到2.47、2.33和2.19，在整個培養(yǎng)過程中，生長最快的是Z1菌株，生長曲線與產(chǎn)酸結(jié)果基本一致。Z2、Z4、Z5和Z6菌株生長速率緩慢，培養(yǎng)遲緩期長，不適宜作為乳酸菌添加劑。

圖1 乳酸菌生長曲線Fig.1 Growth curves of lactic acid bacteria strains

2.4 乳酸菌的16S rDNA序列分析

由表3可知：Z1、Z2、Z3、Z6和Z7菌株的16S rDNA序列信息與NCBI數(shù)據(jù)庫中植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)的基因序列相似度在99%以上，故確定這5株菌株為植物乳桿菌；Z4和Z5菌株與數(shù)據(jù)庫中不動乳桿菌(Acinetobactersp.)的基因序列同源性均在99%以上，故Z4和Z5為不動乳桿菌。

表3 乳酸菌株16S rDNA序列BLAST比對結(jié)果Tab.3 BLAST results of 16S rDNA sequences of lactic acid bacteria strains

3 討論

青貯發(fā)酵是由多種微生物共同參與完成的，而參與青貯過程的微生物主要來自牧草表面附著的微生物[10]。其中，乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、乳球菌屬(Lactococcus)和腸球菌屬(Enterococcus)等在青貯飼料發(fā)酵中起關(guān)鍵作用[11]。隨著乳酸菌的迅速繁殖，發(fā)酵體系中的pH值開始下降，會抑制大部分好氧細(xì)菌、大腸桿菌和霉菌等不利于青貯發(fā)酵的微生物繁殖[12]，使得發(fā)酵品質(zhì)更佳。因此，從青貯飼料中篩選優(yōu)質(zhì)乳酸菌對發(fā)酵品質(zhì)具有重要作用。

本研究對分離出的7株乳酸菌通過形態(tài)學(xué)觀察、產(chǎn)酸速率和生長曲線進(jìn)行初步篩選，并通過16S rDNA基因序列分析方法對菌株進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。16S rDNA同源序列分析方法常應(yīng)用于微生物種和亞種的鑒定，其規(guī)定2個分類單位間的16S rDNA序列同源性大于97.5%，則認(rèn)為他們屬于同一個種[13]。本研究篩選出的3株菌株Z1、Z3和Z7在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST相似性對比，其相似度在99%以上，由此確定3株乳酸菌菌株均為植物乳桿菌。大量研究[10,14-15]表明：植物乳桿菌不僅可從青貯玉米中篩選，在其他青貯牧草中同樣有發(fā)現(xiàn)。郭艷霞等[10]從青貯發(fā)酵的甘蔗尾中分離出20株乳酸菌，其中17株為植物乳桿菌；潘小梅等[14]從青貯的柑橘皮渣中分離出7株乳桿菌屬菌株，其中最優(yōu)良的1株為植物乳桿菌；王紅梅等[15]從呼倫貝爾草原野生牧草青貯中篩選出的優(yōu)質(zhì)菌株也有植物乳桿菌。由此可見，本研究從青貯玉米中篩選出的3株優(yōu)勢乳酸菌菌株有潛力成為青貯飼料乳酸菌添加劑。

產(chǎn)酸速率和生長速率也是青貯添加劑的重要指標(biāo)。MCDONALD等[16]指出：青貯添加劑的菌種應(yīng)具備繁殖速度快、競爭力強、耐酸程度高、pH值降低快、產(chǎn)酸速度快且產(chǎn)酸量大、可廣泛地利用各種可溶性糖等條件。本研究篩選出的7株乳酸菌，其中4株不具備作為青貯添加劑菌種的條件；但Z1、Z3和Z7產(chǎn)酸能力強，繁殖速度快，在36 h時pH值分別為3.79、3.76和3.38，OD值分別為2.47、2.33和2.19。這與崔棹茗等[17]從青稞秸稈青貯飼料中篩選的植物乳桿菌研究結(jié)果相似，其菌株在36 h時pH值降低到3.6以下，OD值在24 h時升至2.4以上。綜合這2項指標(biāo)，篩選出的這3株植物乳桿菌菌株可作為潛在的青貯添加劑后備菌種。

4 結(jié)論

本研究從青貯玉米中共篩選出7株乳酸菌，其中Z1、Z3和Z7產(chǎn)酸能力強，繁殖速度快，均能在12 h內(nèi)pH值下降到4以下、吸光度值(OD值)升至2以上，經(jīng)16S rDNA序列分析鑒定均為植物乳桿菌，可作為青貯添加劑的備選菌種。