李果果，劉金華，宋 娟，李銘燕,4，李冬萍，劉升球，張金蓮,6，陳廷速

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，廣西 南寧 530007；2.浙江養(yǎng)生堂天然藥物研究所有限公司，浙江 杭州 310007；3.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院 微生物研究所，廣西 南寧 530007；4.廣西小藻農(nóng)業(yè)科技有限公司，廣西 防城港 538000；5.廣西特色作物研究院，廣西 桂林 541004；6.廈門大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，福建 廈門 361102)

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是自然界中重要的土壤有益微生物，能與絕大部分陸生植物根系形成共生關(guān)系[1]。由于化學(xué)肥料和農(nóng)藥的大量使用，中國農(nóng)田土壤理化性質(zhì)及微生物系統(tǒng)正在急劇惡化，主要表現(xiàn)為土壤板結(jié)、肥力下降、有機質(zhì)含量降低、鹽漬化加劇和微生物活性下降，從而造成農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)下降等一系列問題[2-6]。AMF在改善土壤生態(tài)方面發(fā)揮著重要作用，可以提高土壤pH值，增加土壤中有機質(zhì)含量，影響宿主植物的根系生長，促進宿主植物的營養(yǎng)吸收以及增強植物的抗逆性[3,7-12]。因此，研究AMF在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用具有重要的生態(tài)學(xué)和經(jīng)濟學(xué)意義。

柑橘是菌根植物，土壤AMF與柑橘根系建立共生關(guān)系[13-14]。柑橘在田間栽培下依靠菌根促進根系對土壤養(yǎng)分和水分的吸收，增強抗逆性[15]。不同生態(tài)型AMF菌株在柑橘上的表現(xiàn)有差異[16]，且AMF對不同宿主植物有偏好性，宿主植物的種類會在很大程度上影響叢枝菌根的生長發(fā)育[17]。資陽香橙 (Citrus junossiebSieb.ex Tanaka)為地方柑橘資源，是宜昌橙與寬皮橘的天然雜種，由于其具有抗堿、抗旱、與多數(shù)柑橘品種嫁接親和、適應(yīng)性強、早果性和豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)性好等優(yōu)點常用作柑橘砧木[18]。近年來，廣西大規(guī)模種植雜交柑品種(如沃柑和茂谷柑)，面積達13.5萬hm2，帶動了廣西柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，其多采用資陽香橙為砧木。本研究以資陽香橙盆栽幼苗接種不同的AMF菌株，篩選促進植株生長明顯的優(yōu)勢菌株，為菌根柑橘種苗的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，也為利用菌根柑橘種苗抑制柑橘黃龍病探索新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為柑橘砧木資陽香橙幼苗；供試花盆為新購置花盆，盆口直徑 15 cm、盆高 12.5 cm、底部直徑11 cm；供試基質(zhì)為育苗有機質(zhì)∶沙∶土按體積比2∶1∶1混勻后裝入滅菌袋中進行高壓蒸汽滅菌，溫度121 ℃，時間120 min。

供試AMF菌株(表1)為廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所土壤微生物課題組前期從廣西土壤分離、純化和保藏的菌株。經(jīng)由三葉草擴繁后獲得，孢子密度為20～100 個/g。

1.2 方法

1.2.1 植株種植

供試資陽香橙種子由1‰高錳酸鉀滅菌2 min、28 ℃培養(yǎng)箱催芽后在穴盤播種，發(fā)芽后選取高10 cm、生長一致的植株移栽于花盆。先在花盆底部墊1張與底部大小一致的紙片，加入1/2已滅菌的基質(zhì)。按照每盆300個孢子的接種量，在植株根部周圍放置AMF接種體，使其與根系充分接觸，繼續(xù)加入基質(zhì)至花盆的3/4，同時保證基質(zhì)沒過根系，按菌株代碼掛上標(biāo)簽。另設(shè)置1個對照組，共16個處理，每處理15盆，共240盆，每14 d淋1次Hoagland營養(yǎng)液。

1.2.2 測定指標(biāo)

經(jīng)過120 d生長后，測量不同AMF菌株處理后資陽香橙植株的莖粗、株高、葉片數(shù)和葉綠素含量。葉綠素含量用葉綠素SPAD值表示，利用葉綠素儀SPAD-502 Plus測量所得。

1.2.3 根系菌根染色

參考王幼珊等[19]的方法并略作改進。將資陽香橙植株根系剪為長約1 cm的小段，放入組織包埋盒中，加 20% KOH，90 ℃水浴0.5 h，清水沖洗3次；加入堿性 H2O2脫色2 h，清水沖洗3次；加5% 冰乙酸酸化2 h；加5%墨水醋染液，66 ℃水浴染色1 h；用清水漂洗3～5次，用清水浸泡12 h以上脫色，確保脫除植物組織顏色、保留菌絲等組織的顏色，以備測定侵染率。

1.2.4 根系菌根侵染率測定

菌根侵染率按照王幼珊等[19]的方法，每處理取30條根系觀察不同AMF對資陽香橙根系侵染情況。使用尼康Eclipse Ci-L和DS-Ri2在顯微鏡下檢查每條根段的侵染情況，按1,10,20,……,100逐等級打分，如：沒有菌根結(jié)構(gòu)的根段記為0，只有一半長度被侵染的根段記為50，全部被侵染的根段記為100。記錄各等級下根段的條數(shù)，根段條數(shù)與其等級乘積之和除以總根段數(shù)即為該樣品的侵染率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用DPS v18.10軟件進行方差分析，并進行Duncan’s多重比較以分析不同AMF菌株處理之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同AMF對資陽香橙根系侵染率

由表2可知：供試的15株菌株均可對資陽香橙根系造成侵染，平均總侵染率為50.97%，其中14株供試菌株的侵染率大于10%，僅菌株AD的侵染率為8.57%。15株供試菌株中，觀察到根外菌絲、根內(nèi)菌絲、泡囊、叢枝、菌絲圈和侵入點的占比分別為93.33%、100.00%、80.00%、100.00%、20.00%和40.00%。對照組(CK)未觀察到真菌侵染的情況。菌株侵染資陽香橙的根外菌絲、根內(nèi)菌絲、泡囊結(jié)構(gòu)及叢植結(jié)構(gòu)的染色圖像如圖1所示。

圖1 AMF侵染資陽香橙根系Fig.1 The infection of AMF in Ziyang Xiangcheng roots

表2 資陽香橙接種不同AMF的根系侵染情況Tab.2 The infection in the roots of Ziyang Xiangcheng with different AMF

2.2 不同AMF菌株對資陽香橙生長的影響

2.2.1 對株高的影響

由圖2可知：對照組植株株高為30.57 cm，15株菌株處理后植株的平均株高為36.90 cm。其中，菌株CE、FM、RF1、SV、RI和GS處理的植株株高均顯著高于對照組(P<0.05)，菌株AD和AE處理的植株株高顯著低于對照組 (P<0.05)，其他處理組的株高與對照組無顯著差異(P>0.05)。

2.2.2 對莖粗的影響

由圖2可知：對照組植株莖粗為2.63 mm，15株菌株處理后的植株平均莖粗為2.88 mm。其中，菌株CE、RI、FM、SV和RF1處理的植株莖粗均顯著高于對照組 (P<0.05)，菌株AD處理的植株莖粗顯著小于對照組 (P<0.05)，其他處理組的莖粗與對照組無顯著差異(P>0.05)。

2.2.3 對葉片數(shù)的影響

由圖2可知：對照組的葉片數(shù)為26.65，15株菌株處理后植株的平均葉片數(shù)為27.18。其中，菌株CE、FM、SV、GS和AR處理的植株葉片數(shù)均顯著高于對照 (P<0.05)，菌株AE和AD處理的植株葉片數(shù)顯著少于對照(P<0.05)，其他處理組的葉片數(shù)與對照組無顯著差異(P>0.05)。

2.2.4 對葉綠素SPAD值的影響

由圖2可知：對照組的SPAD值為57.66，15株菌株處理后植株的平均SPAD值為57.40。其中，菌株FM和CE處理的植株SPAD值顯著高于對照 (P<0.05)，菌株AE和AD處理的植株SPAD值顯著低于對照(P<0.05)，其他處理組的SPAD值與對照組無顯著差異(P>0.05)。

圖2 不同AMF菌株對資陽香橙生長的影響Fig.2 The effect on the plant growth of Ziyang Xiangcheng with different AMF

3 討論

AMF與90%以上的陸生植物根系形成菌根共生體，促進了宿主植物水分和養(yǎng)分的吸收，可改善根系構(gòu)型和增強宿主植物的抗逆性[1,15,20]。影響菌根與植物根系共生的主要因素是共生雙方的生物學(xué)特性及其環(huán)境因子[21]。前人利用 4 種不同的AMF侵染洋蔥，其侵染速度和侵染率有明顯的差異[22]，說明不同菌株和宿主植物親和性不同，同時環(huán)境因子(土壤酸堿度、理化性狀和營養(yǎng)狀況等)均可以影響菌根侵染狀況。柑橘是中國南方重要的果樹之一，其根毛少，屬于典型的叢枝菌根植物，強烈依賴叢枝菌根對水分和養(yǎng)分的吸收功能[15]，從柑橘根系能清楚地觀察到泡囊、叢枝、侵入點、根內(nèi)菌絲、根外菌絲和根外厚垣孢子等結(jié)構(gòu)[14]。不同柑橘品種或不同柑橘砧木對不同的菌根菌種具有明顯不同的依賴性[23]。李艷等[24]研究表明：不同基因型柑橘接種摩西球囊霉后，菌根侵染率、土壤有效磷含量及土壤磷酸酶活性效應(yīng)各不相同，但均以資陽香橙的菌根效應(yīng)最強，其對摩西球囊霉的依賴性最強；吳強勝等[14]研究表明：國慶 1 號溫州蜜柑/枳的菌根侵染率為16.01%～34.73%，國慶 4號溫州蜜柑/枳的菌根侵染率為 20.65%～47.07%；鄧溧[25]研究表明：柑橘種苗接種摩西球囊霉和幼套球囊霉后，根系菌根侵染率均達到60%以上。本研究利用從廣西土壤中分離純化獲得的15株AMF接種資陽香橙種苗，其根外菌絲、根內(nèi)菌絲、泡囊、叢枝、菌絲圈和侵入點的占比分別為93.33%、100.00%、80.00%、100.00%、20.00%和40.00%，根系菌根總侵染率超過70%的菌株包括SV、AR和RF1，侵染率為51%～70%的菌株包括RM、RI、RF2、CE和AS，僅菌株AD的侵染率為8.57%，其余6種菌株的菌根侵染率在20%～50%。

柑橘接種AMF能夠改善根系構(gòu)型，促進根毛發(fā)生，增加植物對水分和養(yǎng)分的吸收[26-27]，所形成的菌根可增加植株對H2O2的清除能力，顯著增強柑橘抗旱性[28-29]。AMF通過誘導(dǎo)植物合成多種酶類、可溶性蛋白和類脂，并調(diào)節(jié)酶活性，平衡植物內(nèi)源激素，促進水分和礦質(zhì)養(yǎng)分的吸收利用，增強光合作用，以提高植物抗旱性、抗病性和其他抗逆性，增加產(chǎn)量和改善品質(zhì)[30]。前人研究表明：幼套近明球囊霉(Claroideoglomus etunicatum)對柑橘[31]、玉米[32]和刺槐[33]有一定的促生效果；摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae)對花生[34]、桑樹[35]、煙草[36]、薰衣草[37]和郁金香[38]均有一定的促生或提高部分抗性效應(yīng)。在本研究中，菌株CE和FM的菌根侵染率分別為58.93%和49.43%，能夠顯著促進資陽香橙的生長；菌株CE、FM和SV處理的資陽香橙株高、莖粗和葉片數(shù)均顯著高于對照 (P<0.05)；菌株CE和FM處理的資陽香橙葉綠素SPAD值顯著高于對照 (P<0.05)，說明菌株與寄主之間的親和性與正效應(yīng)不一定呈線性正相關(guān)。

4 結(jié)論

資陽香橙接種本研究中不同的AMF都能侵染根系，平均侵染率為50.97%。菌株幼套近明球囊霉(C.etunicatum)和摩西斗管囊霉(F.mosseae)對株高、莖粗、葉片數(shù)和葉綠素SPAD值的影響較優(yōu)，說明這2株菌株是促進資陽香橙生長的優(yōu)勢菌株。