管凇 周漢林 徐鐵山 孫衛(wèi)平 胡海超

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所 571101）

生物信息學(xué)技術(shù)是現(xiàn)階段篩選候選功能位點(diǎn)最有效的技術(shù)之一，因此實(shí)驗(yàn)研究中可利用該技術(shù)預(yù)測(cè)未知表型的nsSNPs的功能[1]。已知，現(xiàn)階段研究人員利用各類(lèi)生物信息分析工具對(duì)人類(lèi)或動(dòng)物表型和性狀基因功能性突變進(jìn)行了大量的分析和預(yù)測(cè)，且取得了突破性進(jìn)展[2-6]。本試驗(yàn)主要通過(guò)利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)海南黑山羊GH1 基因編碼區(qū)nsSNPs 的功能。旨在篩選可顯著影響海南黑山羊生長(zhǎng)的功能性突變位點(diǎn)，并分析該突變位點(diǎn)的作用機(jī)理，以期更好的理解黑山羊GH1 基因的作用機(jī)理，同時(shí)也對(duì)應(yīng)用標(biāo)記輔助選擇改善山羊生長(zhǎng)發(fā)育提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 樣品采集和DNA 處理

海南黑山羊樣品采自品資所山羊保種場(chǎng)山羊耳組織。對(duì)104 只成年山羊的體長(zhǎng)、體高、體重進(jìn)行測(cè)量。剪取耳組織，置于裝有75%乙醇的離心管中，4℃保存。采用DNA 提取試劑盒提取耳組織總DNA，用紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)每個(gè)樣品DNA質(zhì)量濃度。

1.2 引物設(shè)計(jì)

從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢(xún)山羊GH1 和IGF2 基因DNA 序列（GenBank 登錄號(hào)分別為：NC_030826 和NC_030836），根據(jù)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的序列信息，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Plex 2 設(shè)計(jì)引物，使用primer3plus 在線設(shè)計(jì)單堿基延伸引物，引物信息見(jiàn)表1。

表1 引物信息

1.3 SNP 位點(diǎn)的篩選和分型

對(duì)提取的DNA 基因組序列進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)總體積為10μL：5μL5×TaqPCRmastermix，上下游引物各0.5μL（20μmol/L），模板DNA1μL (20ng/ul），加ddH2O 至10μL。PCR 擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min；45 個(gè)循環(huán)（94℃，20s；60℃，30s；72℃，30min）；72℃再延伸3min。將PCR 產(chǎn)物去除體系中游離的dNTPs，再進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，反應(yīng)體系總體積5μl。PCR 產(chǎn)物委托武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司采用SnaPshot 方法，用Gene marker 分析得到的.fsa 結(jié)果，導(dǎo)出峰圖及表格文件，并統(tǒng)計(jì)出每個(gè)樣品的SNP 位點(diǎn)的基因型。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用 ROVEN（Protein Variation Effect Analyzer）http://provean.jcvi.org/index.php 和SITF（Sorting Intolerant From Tolerant）https://sift.bii.a-star.edu.sg/和分析nsSNPs 對(duì)蛋白功能的影響，利用http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi 軟件進(jìn)行mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)[7]。利用Sopma（https://npsa-prabi.ib -cp.fr/cgi -bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sop -ma.htm 和CPHmodels（http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/）軟件分別對(duì)突變體的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分別進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，進(jìn)而評(píng)估nsSNPs 可能造成的影響，三級(jí)結(jié)構(gòu)3D 結(jié)果展示使用軟件BIOVIA（https://www.3dsbiovia.com）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)分析

對(duì)海南黑山羊GH1 基因的測(cè)序比對(duì)結(jié)果顯示，在GH1 基因外顯子1、2、3、4 區(qū)域檢測(cè)到10 個(gè)SNP 位點(diǎn)，有4 個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)，4 個(gè)錯(cuò)義突變突變位點(diǎn)測(cè)序峰圖見(jiàn)圖1 和表2。在第一外顯子350bp 處發(fā)生G→A 錯(cuò)義突變，突變位點(diǎn)導(dǎo)致氨基酸由原來(lái)的甘氨酸（Gly）變?yōu)榻z氨酸（Ser），第二外顯子739bp 處發(fā)生G→A 錯(cuò)義突變，突變位點(diǎn)導(dǎo)致氨基酸由原來(lái)甘氨酸（Gly）變?yōu)榻z氨酸（Ser），第三外顯子1101bp 處發(fā)生A→G 錯(cuò)義突變，突變位點(diǎn)導(dǎo)致氨基酸由原來(lái)天冬氨酸（Asp）變?yōu)楦拾彼幔℅ly），第三外顯子1154bp 處發(fā)生C→T 錯(cuò)義突變，突變位點(diǎn)導(dǎo)致氨基酸由原來(lái)精氨酸（Arg）變?yōu)樯彼幔═rp），其余6 個(gè)同義突變位點(diǎn)沒(méi)有導(dǎo)致氨基酸改變。GH1 基因Exon2-729G→A、Exon2-739G→A 兩個(gè)位點(diǎn)在群體中分布的等位基因型頻率突變前后相同，兩個(gè)位點(diǎn)連鎖，Exon3-1101A→G、xon3-1120G→A、Exon3-1154C→T3 個(gè)位個(gè)等位基因型頻率突變前后相同，完全連鎖。

圖1 錯(cuò)義突變位點(diǎn)測(cè)序峰圖

表2 突變位點(diǎn)信息

2.2 不同SNP 位點(diǎn)與性狀關(guān)聯(lián)分析

利用SPSS 軟件統(tǒng)計(jì)各基因的不同SNP 對(duì)應(yīng)的表型（體長(zhǎng)，體高和體重）的平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤差，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)下表4。利用SPSS 中的一般線性模型對(duì)各基因的SNPs 位點(diǎn)與表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，GH1 基因外顯子1、2、3、4 檢測(cè)到10 個(gè)SNP 位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)均只有2 種基因型。一般線性模型的主體間效應(yīng)檢測(cè)結(jié)果顯示，所有SNP 位點(diǎn)基因型與表型（體長(zhǎng)，體高和體重）均未有顯著差異。

表4 突變位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性分析

2.3 SNP 位點(diǎn)的生物信息學(xué)分析

2.3.1 nsSNPs 對(duì)蛋白功能的影響

2.3.1.1 ROVEN 分析

用ROVEN 分析nsSNPs 對(duì)蛋白功能的影響，當(dāng)SNP 的PROVEAN score 分?jǐn)?shù)等于或低于-2.5 的變體被認(rèn)為是“有害的”。當(dāng)SNP 的PROVEAN score 分?jǐn)?shù)高于-2.5 的變體被視為“中性”突變。分析結(jié)果顯示，D129G（天冬氨酸變?yōu)楦拾彼幔┖蚏147W（精氨酸變?yōu)樯彼幔㏒NP 的PROVEAN score 分?jǐn)?shù)低于-2.5，該突變位點(diǎn)屬于有害突變，對(duì)蛋白功能有較大影響見(jiàn)表5。

表5 nsSNPs 的score 評(píng)判分值

2.3.1.2 SITF 分析

用SITF 分析nsSNPs 對(duì)蛋白功能的影響，評(píng)級(jí)為4 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：tolerated、low confidence tolerated、low confidence deleterious、deleterious。當(dāng)SNP 的score 大于0.5 時(shí)，說(shuō)明該SNP 位點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)功能沒(méi)有影響或者影響較??；當(dāng)SNP 的score 小于0.5 時(shí)，說(shuō)明這個(gè)突變的SNP 位點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)功能有較大影響。一個(gè)SNP 的得分越低，危害性越大，分析結(jié)果顯示，G85S（甘氨酸變?yōu)榻z氨酸）、D129G（天冬氨酸變?yōu)楦拾彼幔?、R147W（精氨酸變?yōu)樯彼幔┩蛔兾稽c(diǎn)score＜0.5，該突變位點(diǎn)屬于有害突變，對(duì)蛋白功能有較大影響，見(jiàn)表6。

表6 nsSNPs 的score 評(píng)判分值

2.3.2 mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

對(duì)引起錯(cuò)義突變的GH1 基因Exon1-350G→A、Exon2-739G →A；Exon3-1101A →G、Exon3-1154C →T位點(diǎn)進(jìn)行mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，4 個(gè)突變位點(diǎn)突變前后均引起mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)和自由能發(fā)生變化，Exon1-350G→A 位點(diǎn)的自由能和結(jié)構(gòu)變化較明顯。說(shuō)明基因序列SNPs 突變前和突變后mRNA 自由能的改變、二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變均導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性發(fā)生了改變，見(jiàn)圖2 和表7。

表7 mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)突變前后自由能變化

圖2 mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)突變前后的變化結(jié)果

2.3.3 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

對(duì)引起錯(cuò)義突變的GH1 基因Exon1-350G→A、Exon2-739G→A；Exon3-1120G→A、Exon3-1154C→T 位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明：Exon1-350G→A（G31S）位點(diǎn)突變前后的無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、擴(kuò)展鏈均無(wú)變化，該突變位點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生影響；Exon2-739G→A（G85S）位點(diǎn)突變前后的無(wú)規(guī)則卷曲和擴(kuò)展鏈發(fā)生改變，Exon3 -1120G →A（D129G）、Exon3 -1154C →T（R147W）位點(diǎn)突變前后的α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲發(fā)生改變，這3 個(gè)突變位點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生影響。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 蛋白質(zhì)突變前后二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

2.3.4 位點(diǎn)突變前后蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

突變位點(diǎn)Exon1-350G →A（G31S）、Exon2-739G →A（G85S）、Exon3-1120G →A（D129G）、Exon3-1154C →T（R147W）突變前后蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果三級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)變化一致，Exon1-350G→A（G31S）位點(diǎn)突變前后三級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)變化，該突變位點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生影響；Exon2-739G→A（G85S），Exon3-1120G→A（D129G）、Exon3-1154C→T（R147W）位點(diǎn)突變前后三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化（見(jiàn)圖3），預(yù)測(cè)這3 個(gè)突變位點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能可能會(huì)造成影響。

圖3 突變前后蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)

3 討論

隨著生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，生物信息學(xué)工具已廣泛應(yīng)用于人類(lèi)醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中對(duì)功能性SNP 研究中。該工具可以顯著降低SNPs 的數(shù)目，且能篩選出最有可能的功能性nsSNPs，為后續(xù)功能試驗(yàn)驗(yàn)證提供一定的參考依據(jù)。因此，使用該工具可顯著降低研究成本和工作量[7]。目前較常用的工具為SIFT和ROVEN，建議聯(lián)合使用，以擴(kuò)大數(shù)據(jù)庫(kù)，提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度。單獨(dú)使用某一工具時(shí)預(yù)測(cè)結(jié)果不同，SIFT 預(yù)測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性率更低[8-9]。ROVEN 對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確，但對(duì)中風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度較低[10]，本研究同時(shí)采用SIFT 和ROVEN 兩種方法對(duì)海南黑山羊GH1 基因的外顯子區(qū)的功能性nsSNPs 進(jìn)行了預(yù)測(cè)（表5-6）。預(yù)測(cè)G85S、D129G、R147W3 個(gè)位點(diǎn)可能是有害突變位點(diǎn)。D129G、R147W 兩個(gè)位點(diǎn)突變前后二級(jí)結(jié)構(gòu)的α-螺旋比列下降，無(wú)規(guī)則卷曲比例有上升，G85S 位點(diǎn)的擴(kuò)展鏈發(fā)生變化。通過(guò)nsSNPs、mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，預(yù)測(cè)G85S、D129G、R147W3 個(gè)突變位點(diǎn)可能是導(dǎo)致海南黑山羊個(gè)體矮小，生長(zhǎng)緩慢的功能性SNP。G85S、D129G、R147W3 個(gè)突變位點(diǎn)分別使氨基酸由甘氨酸（Gly）變?yōu)榻z氨酸（Ser），天冬氨酸（Asp）變甘氨酸（Gly），精氨酸（Arg）變?yōu)樯彼幔═rp）。甘氨酸是在氨基酸系列中結(jié)構(gòu)最為簡(jiǎn)單的非極性氨基酸，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是在脊椎里，甘氨酸是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)；絲氨酸是一種非必需氨基酸，在脂肪和脂肪酸的新陳代謝及肌肉的生長(zhǎng)中發(fā)揮著作用；天冬氨酸是一種α-氨基酸，對(duì)肝臟功能有增強(qiáng)作用，消除疲勞；精氨酸為堿性氨基酸，是維持嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育必不可少的氨基酸；色氨酸對(duì)泌乳期的乳牛和母豬有促進(jìn)泌乳作用，當(dāng)畜禽缺乏色氨酸時(shí)，生長(zhǎng)停滯，體重下降，脂肪積累降低。本文預(yù)測(cè)到G85S、D129G、R147W3 個(gè)突變位點(diǎn)屬于有害突變，對(duì)蛋白功能有較大影響，可能是導(dǎo)致海南黑山羊個(gè)體矮小，生長(zhǎng)緩慢的功能性SNP。