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        右美托咪定對(duì)七氟醚麻醉的大鼠下丘腦內(nèi)pCaMKⅡɑ表達(dá)的影響

        2021-12-09 06:42:34王叢叢張巧梅王海青馬登明
        當(dāng)代醫(yī)藥論叢 2021年23期

        王叢叢,張巧梅,沈 莉,王海青,馬登明

        (1. 山東省蒙陰縣人民醫(yī)院麻醉手術(shù)科,山東 蒙陰 276200 ;2. 陜西省空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科,陜西西安 710032)

        吸入式麻醉藥自問(wèn)世以來(lái)已有100 多年的臨床使用歷史。七氟烷是目前臨床上常用的一種吸入式麻醉藥。右美托咪定(dexmedetomidine)是一種新研發(fā)的ɑ2 腎上腺素受體激動(dòng)劑。此藥的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜效果較強(qiáng),因此在臨床上迅速得到推廣應(yīng)用。右美托咪定對(duì)腦的保護(hù)作用在動(dòng)物的腦缺血/ 再灌注模型中已得到證實(shí)[1]。Ca2+/CaM- 依賴(lài)性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin dependent kinase Ⅱ,CaMK Ⅱ)在真核細(xì)胞中普遍存在,可參與細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)的傳導(dǎo),通過(guò)調(diào)控Ca2+對(duì)動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮一定作用[2]。以往的研究表明,磷酸化的CaMK Ⅱ可參與全身麻醉機(jī)制[3]。在使用七氟醚進(jìn)行麻醉時(shí),右美托咪定能否通過(guò)影響磷酸化CaMK Ⅱ而參與全身麻醉機(jī)制仍不能明確[4]。下丘腦是調(diào)節(jié)人體內(nèi)臟活動(dòng)和內(nèi)分泌活動(dòng)的高級(jí)中樞,能通過(guò)多種途徑對(duì)機(jī)體活動(dòng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。本文主要是探討右美托咪定對(duì)使用七氟醚進(jìn)行麻醉的大鼠下丘腦內(nèi)磷酸化Ca2+/CaM-依賴(lài)性蛋白激酶Ⅱα(phosphorylation of Ca2+/calmodulin dependent kinase Ⅱα,pCaMK Ⅱα)表達(dá)的影響。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

        20 只雄性SD 大鼠(由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),其體重為250 g 左右。對(duì)這些大鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守動(dòng)物倫理學(xué)的相關(guān)規(guī)定。

        1.2 材料與儀器

        右美托咪定(由江蘇新晨醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)),無(wú)菌去離子水溶解,凝膠成像儀(由美國(guó)伯樂(lè)Bio-Rad 公司生產(chǎn)),氣體濃度檢測(cè)儀(由西安諾科儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)),1:2000 的CaMK Ⅱ(由上海信裕生物技術(shù)有限公司生產(chǎn),批號(hào)為xy-I006081),腦電監(jiān)測(cè)儀(由上海海神醫(yī)療電子儀器廠(chǎng)生產(chǎn)),自凝牙托粉和牙托水(由河南牙益美醫(yī)療器械貿(mào)易有限公司生產(chǎn),批號(hào)為180917),大鼠腦立體定位儀(由上海玉研科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)P偷闹苽?將濃度為10%的水合氯醛0.5 ml/kg注入大鼠的腹腔內(nèi),對(duì)其進(jìn)行麻醉。采用大鼠腦立體定位儀定位其側(cè)腦室的位置。將2 mL 注射器的針頭打磨成1.7 cm 長(zhǎng)的細(xì)管,在大鼠前囟后0.8 mm、腦正中線(xiàn)旁1.2 mm 處對(duì)其側(cè)腦室進(jìn)行穿刺,穿刺的深度為3.8 mm。穿刺成功后用自凝牙托粉和自凝牙托水固定細(xì)管。將導(dǎo)電針埋于大鼠的頭皮下,待牙托粉凝固后用膠布固定導(dǎo)電針和細(xì)管[5]。

        1.3.2 分組方法及給藥方法 將20 只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照(control,Con)組和右美托咪定(dexmedetomidine,Dex)組,每組各有大鼠10 只。經(jīng)Con 組大鼠的側(cè)腦室小管注入無(wú)菌生理鹽水0.1 mL,經(jīng)Dex 組大鼠的側(cè)腦室小管注入濃度為20μg/mL 的右美托咪定0.1 mL。將腦電監(jiān)測(cè)裝置連在大鼠的頭部,對(duì)其實(shí)施全程腦電監(jiān)測(cè)。注藥30 min 后將兩組大鼠置于密閉的容器中,用6倍最低肺泡有效濃度(minimum alveolar concentration,MAC)的七氟烷對(duì)其進(jìn)行快速麻醉誘導(dǎo)。待其進(jìn)入麻醉狀態(tài)后,用濃度為1.5% 的七氟烷對(duì)其進(jìn)行維持麻醉。麻醉30 min 后停藥,停藥后為其吸入6 L/min 的純氧,對(duì)其進(jìn)行快速洗脫處理,直至其完全清醒。

        1.3.3 大鼠腦電波的監(jiān)護(hù)和記錄 實(shí)驗(yàn)全程密切監(jiān)測(cè)兩組大鼠的腦電波,同時(shí)注意觀(guān)察其行為變化,選擇七氟烷麻醉30 min 時(shí)采集其腦電波進(jìn)行分析。

        1.3.4 大鼠下丘腦內(nèi)pCaMK Ⅱɑ 蛋白表達(dá)的測(cè)定 在麻醉30 min 時(shí),用斷頭脫頸法快速處死兩組大鼠,取出其腦組織。在冰上快速分離出下丘腦組織,用低溫離心機(jī)對(duì)下丘腦組織進(jìn)行離心處理(轉(zhuǎn)速為10 000 rmp/min),保留上清液。以BCA 蛋白試劑為標(biāo)準(zhǔn)品(每例提取標(biāo)本40 μg),求得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)定量。用聚丙烯酰胺凝膠對(duì)上清液進(jìn)行電泳后將其恒壓轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上,并用5% 的脫脂奶粉室溫封閉1 h。隨后加入pCaMK Ⅱ一抗,并在3℃下封閉過(guò)夜。采用辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗將標(biāo)本在室溫下孵育1 h,顯像后對(duì)圖像進(jìn)行分析,明確兩組大鼠下丘腦內(nèi)pCaMK Ⅱɑ 蛋白的表達(dá)情況[6]。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        用SPSS 20.0 軟件處理本研究中的數(shù)據(jù),計(jì)量資料用±s表示,組間比較采用單因素方差分析,兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),多樣本均數(shù)比較采用One-way ANOVA 檢驗(yàn),P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 兩組大鼠的腦電記錄及波形分析

        用七氟烷麻醉30 min 時(shí),采集兩組大鼠的腦電波進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),與Con 組大鼠相比,Dex 組大鼠的抑制性腦電波(δ 波)增多(P<0.05),興奮性腦電波(α 波、β 波)減少(P<0.05)。詳見(jiàn)圖1。

        圖1 兩組大鼠的腦電波頻譜

        2.2 兩組大鼠下丘腦內(nèi)pCaMK Ⅱɑ 蛋白的表達(dá)情況

        用七氟烷麻醉30 min 時(shí),與Con 組大鼠相比,A 組大鼠下丘腦內(nèi)pCaMK Ⅱɑ 蛋白的表達(dá)量更低(P<0.05)。與Con 組大鼠、A 組大鼠相比,B 組大鼠下丘腦內(nèi)pCaMK Ⅱɑ 蛋白的表達(dá)量更低(P<0.05)。詳見(jiàn)圖2、圖3。

        圖2 大鼠下丘腦內(nèi)pCaMK Ⅱɑ 蛋白的相對(duì)分子量

        圖3 大鼠下丘腦內(nèi)pCaMK Ⅱɑ 蛋白的相對(duì)表達(dá)量

        3 討論

        吸入式麻醉是指揮發(fā)性麻醉藥物經(jīng)呼吸系統(tǒng)入血,抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)而達(dá)到麻醉目的的一種麻醉方法。吸入式麻醉藥在體內(nèi)分解、代謝較少,大部分藥物能以原形從肺部排出體外,具有較高的安全性、可控性[7]。近年來(lái),七氟烷吸入式麻醉在外科手術(shù)中應(yīng)用越來(lái)越廣泛[8]。鹽酸右美托咪定是一種高選擇性ɑ2 受體激動(dòng)劑,能通過(guò)激動(dòng)腦干藍(lán)斑核和脊髓背角的ɑ2 受體而產(chǎn)生鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、催眠的作用。此藥除了具有上述作用外,其在腦保護(hù)、抗炎等方面的作用也逐漸受到人們的關(guān)注[9-10]。生物電現(xiàn)象是生命活動(dòng)的基本特征之一,各種生物均有電活動(dòng)的表現(xiàn)。腦電波是腦神經(jīng)細(xì)胞的電生理活動(dòng)在大腦皮層或頭皮表面的總體反映[11-12]。腦電波中的δ 波是麻醉狀態(tài)下的典型波形,在成人極度疲勞或昏睡狀態(tài)下易產(chǎn)生。腦電波中的α 波、β 波是成人在清醒狀態(tài)下出現(xiàn)的腦電波[13-14]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)側(cè)腦室為大鼠注入右美托咪定后,采用七氟烷對(duì)其進(jìn)行麻醉,麻醉30 min 時(shí)取其腦電波進(jìn)行頻譜分析,發(fā)現(xiàn)其抑制性腦電波δ 波明顯增加,興奮性腦電波α 波、β 波明顯減少。這一結(jié)果不僅符合右美托咪定的藥理特性,更從電生理學(xué)層面印證了此藥的效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)用七氟烷麻醉30 min 時(shí)及動(dòng)物清醒狀態(tài)下取大鼠的下丘腦組織進(jìn)行免疫印記分析發(fā)現(xiàn),Dex 組大鼠下丘腦內(nèi)pCaMK Ⅱɑ 的表達(dá)量在麻醉30 min時(shí)明顯降低,這一指標(biāo)在其完全清醒后逐漸升高并恢復(fù)正常。這一結(jié)果表明右美托咪定能在一定程度上抑制動(dòng)物腦內(nèi)pCaMK Ⅱɑ 的表達(dá)。現(xiàn)階段,全身麻醉技術(shù)已十分成熟,但關(guān)于麻醉藥物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍較為局限。近年來(lái),多種參與睡眠覺(jué)醒的中樞神經(jīng)遞質(zhì)(如多巴胺、乙酰膽堿、γ- 氨基丁酸等)相繼被證實(shí)參與了麻醉分子機(jī)制[15]。電生理、磁共振等方面的研究也發(fā)現(xiàn),除了經(jīng)典的大腦皮層、腦干、脊髓外,一些未受重視的中樞結(jié)構(gòu)(如下丘腦)也是麻醉藥的敏感區(qū)域[15-16]。

        綜上所述,右美托咪定可對(duì)使用七氟醚進(jìn)行麻醉大鼠的腦電波產(chǎn)生抑制,還可抑制麻醉過(guò)程中其下丘腦內(nèi)pCaMK Ⅱɑ 的表達(dá)。關(guān)于右美托咪定導(dǎo)致動(dòng)物意識(shí)消失及意識(shí)恢復(fù)的機(jī)制,仍需要通過(guò)進(jìn)一步的研究來(lái)發(fā)現(xiàn)、證實(shí)。

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