黃日昇 李軼春 陳文雄 鄧家慶 彭云娟

摘要：目的 通過對新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）核酸檢測實驗室的環(huán)境SARS-CoV-2核酸監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)潛在污染源并采取相應(yīng)有效措施，消除或避免核酸檢測實驗室污染。方法 在2020年5月20日至2020年5月23日北海市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學檢驗科SARS-CoV-2核酸檢測假陽性結(jié)果突發(fā)增多期間，對該實驗室實行去污染源和環(huán)境SARS-CoV-2監(jiān)測。結(jié)果 試劑準備區(qū)、標本制備處理區(qū)環(huán)境監(jiān)測點SARS-CoV-2核酸檢測陰性;擴增及產(chǎn)物分析一區(qū)為產(chǎn)物污染，環(huán)境監(jiān)測點均檢測出SARS-CoV-2核酸陽性，對操作臺面、PA7600熒光定量基因擴增儀擴增倉、分析區(qū)空氣進行14天SARS-CoV-2核酸監(jiān)測，污染物清除期其CT值分別為37.0±1.41，36.8±2.03和37.0±2.16，污染物清除后觀察期CT值分別為45.8±0.38，45.7±0.75和45.8±0.38，差異具有統(tǒng)計學意義（F=5.75，10.28，11.53 均P<0.05）。結(jié)論 SARS-CoV-2核酸檢測實驗室制定并落實環(huán)境監(jiān)測制度，行之有效的預(yù)防或清除污染措施和應(yīng)急預(yù)案對病原微生物安全防護極其重要。

關(guān)鍵詞：新型冠狀病毒核酸檢測;實驗室污染 ;環(huán)境監(jiān)測

【中圖分類號】G644.5?【文獻標識碼】A?【文章編號】1673-9026（2021）13-02

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）是一種新型β屬冠狀病毒，單鏈 RNA病毒，是引發(fā)新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）主要病原微生物，基因組序列約由29kb構(gòu)成，擁有10個基因，可有效編碼10個蛋白[1]。據(jù)國家衛(wèi)健委公布的《新型冠狀病毒的肺炎診療方案（試行第七版）》[2]，實時熒光RT-PCR是SARS-CoV-2確診病例的診斷標準之一，因其具有高敏感性，特異性好，操作簡單等特點，成為了疫情暴發(fā)期間最主要的實驗室檢測手段，廣范應(yīng)用于各種病原學檢測領(lǐng)域[3-6]，但實驗室也極容易引起污染。依據(jù)《病原微生物實驗室生物安全管理條例》[7]、《實驗室生物安全通用要求》（GB19489）[8]、《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南（第二版）》[9] 和《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術(shù)指南（第四版）》[10] 等要求，SARS-CoV-2核酸檢測必須確保生物安全。本文旨在通過對SARS-CoV-2核酸檢測實驗室的環(huán)境SARS-CoV-2核酸監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)潛在污染源并采取相應(yīng)有效措施，消除或避免核酸檢測實驗室污染，為SARS-CoV-2核酸檢測提供建設(shè)性意見。

1材料與方法

1.1采樣對象 于2020年5月20日至2020年5月23日北海市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學檢驗科SARS-CoV-2核酸檢測假陽性結(jié)果突發(fā)增多期間，對實驗室試劑準備區(qū)、標本制備處理區(qū)和擴增及產(chǎn)物分析一區(qū)環(huán)境監(jiān)測點進行SARS-CoV-2核酸檢測分析。

1.2儀器與試劑?中山達安DA7600、天隆GENTIER 96熒光定量基因擴增儀、Auto-pure32A型全自動核酸提取儀、鑫貝西生物安全柜、上海康禾H-1微型混合器、LX-300微型離心機;中山達安新型冠狀病毒核酸檢測試劑、廣州賽百純核酸提取試劑、H3-1采樣管、帶過濾芯吸頭。

1.3方法

1.3.1 采樣方法 于SARS-CoV-2核酸檢測假陽性結(jié)果突發(fā)增多期間，實驗活動與環(huán)境消毒前，物表監(jiān)測點使用病毒采樣拭子蘸取H3-1采樣液，對操作臺面、移液器表面及吸嘴、儲存冰箱、傳遞窗把手、核酸提取儀、熒光定量基因擴增儀擴增倉、生物安全柜內(nèi)壁反復涂抹，然后采樣拭子回收洗脫至H3-1采樣管;空氣監(jiān)測則使用空氣沉降法，打開H3-1采樣管蓋子使采樣液暴露于固定監(jiān)測位置30Min。

1.3.2檢測方法 按照SARS-CoV-2核酸檢測標準程序，對核酸實驗室所有工作區(qū)環(huán)境監(jiān)測點進行SARS-CoV-2核酸檢測，結(jié)合CT值和熒光曲線判定結(jié)果，內(nèi)源性檢測系統(tǒng)（內(nèi)標，IC）曲線S型擴增，ORF1ab和N基因同時擴增（CT≤40），結(jié)果為SARS-CoV-2核酸陽性;ORF1ab和N基因無擴增（CT≥45），結(jié)果為SARS-CoV-2核酸陰性;ORF1ab和N基因無明顯擴增（CT40-45），結(jié)果為檢測灰區(qū)，需要重測復查;ORF1ab或N基因單通道擴增（CT≤40），重新采集標本復查，復查結(jié)果一致時，報告SARS-CoV-2 ORF1ab或N單基因核酸陽性，復查結(jié)果為雙基因均陰性時，報告SARS-CoV-2核酸陰性;IC 曲線無S型擴增，需要重測或者重采標本測定[11]。所有該實驗室SARS-CoV-2核酸檢測陽性標本均按要求轉(zhuǎn)送至北海市疾病預(yù)防控制中心核酸實驗室再次復核。

1.3.3污染源清除方法?每天3次，連續(xù)7天清洗空調(diào)過濾網(wǎng)，對儀器設(shè)備（如基因擴增儀擴增倉與外表、生物安全柜內(nèi)壁、核酸提取儀、移液器等）75%酒精擦拭，500 -1000mg/L的84消毒液擦拭工作臺面、冰箱、傳遞窗把手，拖擦地面，作用10 min后用清水擦拭工作臺面等物表，打開實驗室紫外燈照射≥1 h[12-13]，保持開窗通風排氣。

1.3.4污染源清除驗證方法 對實驗室污染區(qū)環(huán)境監(jiān)測點連續(xù)14天SARS-CoV-2核酸監(jiān)測，連續(xù)7天檢測SARS-CoV-2核酸陰性，判定為污染源清除成功，實驗室可正常使用運行。

1.3.5應(yīng)急預(yù)案的啟動?實驗室生物安全領(lǐng)導小組通過環(huán)境監(jiān)測結(jié)果分析污染源并進行生物安全自查，根據(jù)污染類型、范圍及危害程度上報醫(yī)院生物安全管理委員會，由其決定封閉污染區(qū)域，選擇清除污染的方法與清除驗證方法，啟用備用實驗用房和儀器設(shè)備，進行生物安全評估等。

1.3.6質(zhì)量控制?使用中山達安試劑盒配套質(zhì)控品（批號2020056）、陰性和陽性對照一同與樣本檢測，使用常規(guī)質(zhì)量控制規(guī)則，確?？煽康膶嶒灆z測質(zhì)量。

1.4統(tǒng)計學軟件分析?統(tǒng)計分析采用SPSS 22.0軟件，計數(shù)資料以百分比（%）表示，其比較采用卡方檢驗，計量資料以均值±標準差（）表示，其比較采用T檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 實驗區(qū)域環(huán)境監(jiān)測點SARS-CoV-2核酸檢測?試劑準備區(qū)、標本制備處理區(qū)環(huán)境監(jiān)測點SARS-CoV-2核酸檢測均為陰性，擴增及產(chǎn)物分析一區(qū)為產(chǎn)物污染，環(huán)境監(jiān)測點均檢測出SARS-CoV-2核酸陽性，具體見表1至表3。

2.2 污染源清除驗證監(jiān)測?對擴增及產(chǎn)物分析一區(qū)使用污染源清除和驗證方法，啟動SARS-CoV-2核酸檢測實驗室應(yīng)急預(yù)案，連續(xù)14天SARS-CoV-2核酸監(jiān)測，污染物清除后監(jiān)測期比污染物清除監(jiān)測期，CT值均值明顯升高，連續(xù)7天SARS-CoV-2核酸陰性（CT≥45），差異具有統(tǒng)計學意義（F=5.75，10.28，11.53 均P<0.05），見表4。

3討論

據(jù)中新網(wǎng)報道，新冠疫情發(fā)生以來，SARS-CoV-2核酸檢測實驗室由原來的2081家增加至4804家，其中1350家為新準入二級醫(yī)院實驗室，提高了核酸檢測能力，但同時發(fā)現(xiàn)部分臨床基因擴增實驗室設(shè)計布局不合理，未能達到相應(yīng)生物安全防護要求;部分實驗室人員生物安全防護意識嚴重弱化，個人防護用品不足[14];檢測人員資質(zhì)不符合要求;實驗人員體力及心理負擔過重;生物安全手冊、風險評估程序、標準作業(yè)指導書不全或缺失等問題，使SARS-CoV-2核酸檢測實驗室污染風險增加。

目前核酸實驗室污染的主要類型有：①標本污染;②試劑污染;③產(chǎn)物污染。污染處理過程耗時且繁瑣，所以采取有效的預(yù)防污染措施極為重要。常見預(yù)防實驗室污染措施有：①實驗室布局設(shè)置合理。設(shè)計有門禁系統(tǒng)并粘貼生物安全警示標識，至少應(yīng)設(shè)置3個獨立工作區(qū)域： 試劑儲存區(qū)、標本制備區(qū)和擴增及產(chǎn)物分析區(qū)。各區(qū)在空間上相互獨立，實驗用品實行專區(qū)專用，處于物理分隔狀態(tài)，分別設(shè)有緩沖區(qū)域。②實驗室人員和物品應(yīng)按照從一區(qū)→二區(qū)→三區(qū)的單向工作流向制度，不得逆向流動。③嚴格的人員準入進入制度。④核酸檢測實驗室標本制備區(qū)設(shè)置專用SARS-CoV-2核酸提取間（負壓實驗室，氣壓符合要求）進行病毒核酸提取，避免與其他核酸檢測項目混用，確保生物安全。標本的開蓋、取樣、震蕩等操作必須在生物安全柜內(nèi)進行，再轉(zhuǎn)移到全自動核酸提取儀進行核酸提取。該區(qū)域操作者需三級生物安全防護，嚴格執(zhí)行防護用品穿戴程序和互相糾正程序及制度[15-17]。⑤每次實驗結(jié)束后執(zhí)行消毒程序，即使用75%酒精噴灑生物安全柜或其他儀器，然后用一次性紙巾擦拭;實驗室臺面使用1000mg/L有效氯消毒液擦拭，實驗室地面采用500-1000mg/L有效氯消毒液拖地消毒（拖把分區(qū)放置，不可以共用），打開生物安全柜及實驗室紫外燈消毒>2h，實驗室所有垃圾均視為有傳染性醫(yī)療垃圾，均需高壓滅菌消毒處理。⑥重視實驗室人員的身體和心理健康，適當減少輪流排班次數(shù)，注重心理輔導。⑦健全實驗室質(zhì)量管理體系文件，特別是生物安全管理制度。⑧制定并落實環(huán)境監(jiān)測制度，包括監(jiān)測頻率（間隔）、取樣方法、取樣主要范圍，任一方法/部位環(huán)境監(jiān)測結(jié)果不合格，均應(yīng)采取相應(yīng)措施加強實驗室清潔消毒，直至環(huán)境監(jiān)測結(jié)果全部合格。

本文通過實驗室環(huán)境監(jiān)測點SARS-CoV-2核酸檢測發(fā)現(xiàn)為擴增及產(chǎn)物分析區(qū)產(chǎn)物污染，通過實驗跟蹤分析發(fā)現(xiàn)，某廠商八聯(lián)管加蓋后，在重復高溫變性、低溫退火和延伸三個循環(huán)中蓋子變形導致產(chǎn)物片段泄露引起產(chǎn)物污染，采取更換新批次八聯(lián)管和使用污染源清除方法后，只用了14天就成功清除了污染源，因此環(huán)境SARS-CoV-2核酸監(jiān)測為污染源的查找分析、污染類型判斷提供了依據(jù)，而行之有效的預(yù)防或清除污染措施為污染源的清除提供了保障，贏得了時間。

本次SARS-CoV-2核酸檢測實驗室污染處置過程中，實驗室生物安全領(lǐng)導小組迅速自查并把污染類型、范圍及危害程度上報醫(yī)院生物安全管理委員會，由其啟用了應(yīng)急預(yù)案，迅速啟用了備用實驗用房和儀器設(shè)備（天隆GENTIER 96熒光定量基因擴增儀），為后期SARS-CoV-2污染源清除驗證和臨床標本檢測的正常運行提供了可靠的保障。由此可見在新核酸檢測實驗室規(guī)劃時，實驗預(yù)備用房尤為重要，我們不單著眼于滿足行業(yè)標準的試劑準備區(qū)、標本制備處理區(qū)和擴增及產(chǎn)物分析區(qū)這三個工作區(qū)，而應(yīng)該放眼于未來實驗室發(fā)展擴大與應(yīng)急需求，設(shè)計有SARS-CoV-2專用核酸提取間和擴增及產(chǎn)物分析備用區(qū)對病原微生物防護十分重要。另外制定應(yīng)急預(yù)案時不單要考慮職業(yè)暴露、運輸泄漏、火災(zāi)、水災(zāi)、地震等緊急情況，更要考慮實驗室污染、核酸實驗室人員工作突發(fā)休克等突發(fā)情況的緊急處置能力等。

值得提出的是，COVID-19為當下新發(fā)疫情，SARS-CoV-2核酸檢測也是應(yīng)對疫情新開展項目，本次環(huán)境環(huán)境監(jiān)測點采集的樣本數(shù)量有限，并不能全部反映整個實驗的污染情況，對于低污染狀態(tài)下評價準確性降低，未檢出不代表沒有污染，由此可見制定并落實SARS-CoV-2核酸檢測實驗室預(yù)防實驗室污染措施就更顯得重要。

綜上所述！新型冠狀病毒核酸檢測實驗室制定并落實環(huán)境監(jiān)測制度、行之有效的預(yù)防或清除污染措施和應(yīng)急預(yù)案對微生物安全防護極其重要。

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作者簡介：黃日昇（1981-），男，本科學士，副主任技師，研究方向：微生物及免疫學，E-mail：HRS_9919@163.com。

通訊作者：李軼春（1974-），男，研究生學歷，副主任技師，E-mail：782383597@qq.com。