武曉曉，婁兵海，唐 艷，陳傳武，劉 萍，章慧璇，范七君，黃俊源，門友均，鄧崇嶺

（1 廣西特色作物研究院，廣西柑橘育種與栽培工程技術(shù)研究中心，桂林541004）（2 廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院）

柑橘黃龍病是一種世界性的柑橘毀滅性病害，主要通過柑橘木虱、嫁接、帶病的苗木傳播，也可以通過菟絲子傳播，每年對我國柑橘產(chǎn)業(yè)造成的經(jīng)濟損失有數(shù)十億元。柑橘黃龍病不但造成很大的經(jīng)濟損失，且其防治也非常困難，目前，只能說是可防可控，而無法根治[1-3]。眾多科研院所經(jīng)十幾年研究，仍未搞清楚其致病機理，主要障礙在于病菌不能培養(yǎng)和缺少抗病品種[4-8]。

廣西的柑橘黃龍病出現(xiàn)于20 世紀(jì)30 年代，其發(fā)生歷史已近1個世紀(jì)，廣西中部和南部20 世紀(jì)七八十年代發(fā)展起來的柑橘園幾乎全部毀于柑橘黃龍病，面積超過6.67 萬hm2，直接經(jīng)濟損失超過100 億元[9-10]。由于柑橘黃龍病在廣西發(fā)生歷史久，發(fā)生面廣，損失慘重，感病樹基數(shù)大，因此，從中獲得耐柑橘黃龍病種質(zhì)材料是有可能的。

課題組在2012—2020 年調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，在少數(shù)果園有個別柑橘植株存活30～50 年，生長結(jié)果正常，而周邊柑橘植株被黃龍病毀掉2～3 代；還有已感染黃龍病10～20 年的柑橘樹，個別枝條生長結(jié)果正常，表明在田間可能也存在耐黃龍病的柑橘植株變異資源，這些變異資源是解析致病機理、尋找抗病基因[10-12]的寶貴資源。因此，篩選出對柑橘黃龍病具有耐性的柑橘種質(zhì)材料，并在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用，是解決柑橘黃龍病危害最根本的途徑，對柑橘產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為廣西壯族自治區(qū)范圍內(nèi)的野生柑橘種質(zhì)資源和疑似耐（抗）柑橘黃龍病柑橘種質(zhì)材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 疑似耐（抗）柑橘黃龍病種質(zhì)材料收集、選種及鑒定方法

2012—2020 年，在廣西壯族自治區(qū)范圍內(nèi)對野生柑橘種質(zhì)資源和田間疑似耐（抗）柑橘黃龍病的種質(zhì)材料進行選種和收集，選種及收集時期為整個柑橘生長季，重點在秋、冬季柑橘黃龍病病癥表現(xiàn)期。

1.2.2 疑似耐（抗）柑橘黃龍病柑橘種質(zhì)材料的保存

課題組對篩選出的疑似耐（抗）柑橘黃龍病柑橘種質(zhì)材料，通過嫁接的方式進行擴繁，種植在塑料桶里進行保存，建立耐（抗）柑橘黃龍病柑橘種質(zhì)材料保存圃。

1.2.3 疑似耐（抗）柑橘黃龍病柑橘種質(zhì)材料的高接染毒鑒定法

（1）高接。在果園中選取已經(jīng)感染黃龍病的柑橘樹，進行定性PCR 檢測加以確定。高接方法主要為春接，春接時間為2—4 月，高接方式為單芽切接，在高接樹上選取直徑0.5 cm 以上的枝條，從樹皮平滑處剪斷，在枝條斷面下方沿皮層與木質(zhì)部交界處向下縱切1 刀，露出形成層，切面要短于接穗芽，然后從待鑒定的種質(zhì)材料的枝條上切取單芽，再插入中間砧枝條切口上，對準(zhǔn)形成層并用嫁接膜綁縛。

（2）田間癥狀觀察。高接4個月后，根據(jù)待鑒定的種質(zhì)材料抽出的枝梢的癥狀來進行診斷：枝梢生長良好、無黃梢、無斑駁型黃化葉片或僅有輕微葉片黃化癥狀，則初步判定該種質(zhì)材料對柑橘黃龍病具有耐性；枝梢生長較弱、黃梢嚴(yán)重、葉片斑駁型黃化癥狀明顯，則初步判定該種質(zhì)材料對柑橘黃龍病不具有耐性。

（3）實時熒光定量PCR 檢測。采集高接成活且初步判定為耐柑橘黃龍病種質(zhì)材料的葉片，采用改良CTAB 法[13]提取葉脈DNA，得到待測樣品的DNA 模板；從健康柑橘樹的葉脈中提取DNA，作為陰性對照；從柑橘黃龍病樹的葉脈中提取DNA，作為陽性對照；參照Li 等[14]報道的方法進行實時熒光定量PCR 擴增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算病原菌含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 疑似耐（抗）柑橘黃龍病種質(zhì)材料的收集

本研究共收集疑似耐（抗）柑橘黃龍病種質(zhì)材料177 份，其中野生柑橘資源19 份（表1）；田間疑似耐（抗）柑橘黃龍病種質(zhì)材料158 份（表2），包括‘砂糖橘’25 份、‘沙田柚’29 份、椪柑65份、橙類19 份、‘桂橘一號’5 份、溫州蜜柑10份、‘蜜廣橘’2 份、‘南豐蜜橘’1 份及其他柑橘材料2 份。

2.2 疑似耐（抗）柑橘黃龍病種質(zhì)材料的PCR 檢測

對收集到的177 份疑似耐（抗）柑橘黃龍病種質(zhì)材料進行PCR 檢測，如表1、表2 所示，檢測結(jié)果均為陰性，表明這些單株（材料）均未感染黃龍病菌。

表1 野生柑橘種質(zhì)材料收集情況及檢測結(jié)果

續(xù)表2

2.3 疑似耐（抗）柑橘黃龍病種質(zhì)材料的保存

對篩選出的177 份疑似耐病材料通過嫁接的方式進行擴繁，種植在塑料桶內(nèi)進行保存，建立耐（抗）柑橘黃龍病種質(zhì)材料保存圃1個（圖1），可以滿足后續(xù)高接鑒定以及其他相關(guān)試驗的需要。

圖1 疑似耐（抗）柑橘黃龍病種質(zhì)材料保存圃

2.4 疑似耐（抗）柑橘黃龍病種質(zhì)材料的鑒定

2.4.1 田間癥狀觀察

分別于2018 年3 月和2019 年3 月對收集、保存的疑似耐（抗）柑橘黃龍病種質(zhì)材料進行高接染毒鑒定（圖2），高接成活4個月后田間黃龍病典型斑駁型葉片黃化癥狀明顯（圖3），對待鑒定材料進行黃龍病田間癥狀觀察和統(tǒng)計，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)部分材料沒有表現(xiàn)黃龍病癥狀，與其他材料相比表現(xiàn)出了耐病性。

圖2 高接染毒鑒定試驗

圖3 田間黃龍病葉片黃化癥狀

2.4.2 黃龍病PCR 檢測

在觀察待鑒定材料田間癥狀的同時采集樣品，進行定性/定量PCR 檢測，結(jié)果表明部分材料感染黃龍?。z測結(jié)果為陽性）時間較晚，例如陽性對照在高接5個月后（2019 年8 月）檢測到已感染黃龍病，KH-9、KHY-2 在高接8個月后（2019 年11月）才檢測到，GCC-8 甚至在高接11個月后（2020年2 月）才檢測到（表3）。

表3 部分種質(zhì)材料不同時期定性PCR 檢測結(jié)果

感染黃龍病后，對待鑒定材料和陽性對照進行黃龍病菌定量檢測，結(jié)果顯示KHY-2 植株內(nèi)的黃龍病菌平均含量為123 520.0個細(xì)胞/μg DNA，而陽性對照植株內(nèi)的黃龍病菌平均含量為3 623 351.0個細(xì)胞/μg DNA，KHY-2 中的黃龍病菌含量始終明顯低于陽性對照（圖4）。

圖4 KHY-2 種質(zhì)材料不同時期黃龍病菌含量

經(jīng)過2 年的試驗研究，共篩選出16 份耐柑橘黃龍病的種質(zhì)材料，其中包括野生柑橘材料4 份、田間耐病材料12 份（表4）。

表4 耐柑橘黃龍病的種質(zhì)材料

3 討論與結(jié)論

從1919 年黃龍病首次被報道至今，關(guān)于柑橘和柑橘近緣種對黃龍病的抗性或耐受性的報道屢見不鮮。Vand 等[15]通過嫁接試驗鑒定了15個柑橘品種對黃龍病的耐病能力，依據(jù)表現(xiàn)出的癥狀可以將它們分為5 組：重癥組、中癥組、輕癥組、耐病組和抗病組。Stover 等[16]對受黃龍病嚴(yán)重影響的佛羅里達州的主要商業(yè)化柑橘品種進行了耐病評價。其中‘Temple’表現(xiàn)出的HLB 癥狀最輕，而‘默科特’和‘米尼奧拉’的癥狀最明顯?！甋ugar Belle’橘和‘Bearss’檸檬與其他品種相比對黃龍病具有顯著的耐病能力[17]。滕彩玲等[18]研究發(fā)現(xiàn)，‘馬蜂柑’具有較強耐病性，且其作為中間砧亦可顯著延緩甜橙的發(fā)病時間。枳與‘印度野橘’雜交后代‘US-897’接種黃龍病菌后沒有明顯感病癥狀，果實生長正常，樹體生長幾乎不受影響[19]。以上研究都表明，不同的柑橘品種對黃龍病表現(xiàn)的耐病性存在很大的差異。

本研究通過大田株選的方法，對廣西壯族自治區(qū)內(nèi)的疑似耐（抗）柑橘黃龍病種質(zhì)材料進行選種、收集和保存，共收集和保存疑似耐（抗）柑橘黃龍病材料177 份，其中野生柑橘材料19 份，田間疑似耐（抗）柑橘黃龍病種質(zhì)材料158 份，建立耐（抗）柑橘黃龍病種質(zhì)材料保存圃1個，并通過高接染毒法對這些材料進行鑒定，結(jié)合田間黃龍病癥狀觀察與定性/定量PCR 檢測結(jié)果，共篩選出16 份對柑橘黃龍病表現(xiàn)耐性的種質(zhì)材料，其中野生資源4 份，田間耐病材料12 份。耐柑橘黃龍病材料的具體表現(xiàn)為：①與同時期高接染毒的材料相比，感染黃龍病的時間較晚，即檢測到黃龍病菌的時間較晚；②感染黃龍病后，植株表現(xiàn)較為正常，黃龍病癥狀不明顯；③感染黃龍病后，經(jīng)過定量PCR 檢測顯示，植株體內(nèi)黃龍病菌含量顯著低于其他材料。本研究采用高接染毒鑒定法對疑似耐（抗）柑橘黃龍病種質(zhì)材料開展黃龍病的耐性鑒定和評價工作，為柑橘的抗病育種奠定了理論和實際基礎(chǔ)。