譚 健 王 榮 張秀敏 馬志遠(yuǎn) 王 敏* 譚支良

(1.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，長沙 410125；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，呼和浩特 010018)

畜牧業(yè)溫室氣體排放被認(rèn)為是農(nóng)業(yè)活動領(lǐng)域最主要的排放源之一[1]。目前，研究人員已經(jīng)證實甲烷是引發(fā)地球表面溫室效應(yīng)不斷增加的主要原因[2]。在畜牧業(yè)甲烷排放中，97%的甲烷來自于反芻家畜[3]。除此之外，反芻動物甲烷排放是導(dǎo)致飼料能量損失的重要因素，占飼糧攝入總能的2%～12%[4]。因此，如何減少反芻動物胃腸道甲烷排放已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點科學(xué)問題。反芻家畜87%～89%的甲烷是在瘤胃內(nèi)產(chǎn)生[5]，并且瘤胃內(nèi)80%以上的甲烷是由甲烷菌利用氫和二氧化碳合成[6]。有研究結(jié)果表明，在飼糧中添加可以利用氫的添加劑，可以改變瘤胃內(nèi)氫的流向，減少氫被甲烷菌的利用，進(jìn)而降低甲烷排放[7-8]。

亞麻籽油是一種富含不飽和脂肪酸的優(yōu)質(zhì)性植物油脂，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種反芻家畜的研究[9-13]。亞麻籽油進(jìn)入瘤胃后發(fā)揮作用的機(jī)制主要分為2個方面：一方面，在瘤胃微生物的作用下發(fā)生生物氫化反應(yīng)，最終生成硬脂酸[14]。在這個過程中，亞麻籽油會作為氫池與甲烷菌競爭氫的利用。另一方面，亞麻籽油中的不飽和脂肪酸會通過與細(xì)菌礦物質(zhì)反應(yīng)形成皂化物，改變細(xì)菌細(xì)胞膜的生物流動性，從而對微生物產(chǎn)生毒害作用[15]。這2種不同的作用機(jī)制會對瘤胃內(nèi)氫代謝和甲烷生成產(chǎn)生不同的影響，因此，本研究旨在從瘤胃內(nèi)氫代謝相關(guān)的代謝產(chǎn)物著手，揭示不同劑量的亞麻籽油抑制瘤胃甲烷生成的作用機(jī)制，研究結(jié)果可以為提高反芻家畜能量利用效率和減少甲烷排放提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵底物

本試驗取500 g左右的青貯玉米樣品，在65 ℃條件下烘干，粉碎并過1 mm篩，然后存放在密封袋中備用。發(fā)酵底物中添加的亞麻籽油購買于張家口市某食用油有限責(zé)任公司，產(chǎn)品符合GB/T 8325—2008標(biāo)準(zhǔn)一級要求，含有肉豆蔻酸0.01%、棕櫚酸5.93%、棕櫚油酸0.05%、十五烷酸0.05%、硬脂酸3.54%、順式油酸17.70%、亞油酸17.60%、亞麻酸54.70%、花生酸0.28%、花生烯酸0.14%。為了能夠確保亞麻籽油與發(fā)酵底物混合均勻，通過乳化和酶解技術(shù)，將亞麻籽油與膨化玉米等重量均勻混合。本試驗設(shè)置6種添加劑量[0(對照)、1%、2%、3%、4%和5%，干物質(zhì)基礎(chǔ)]，以亞麻籽油替代膨化玉米，確保最終每個發(fā)酵瓶中發(fā)酵底物、亞麻籽油和膨化玉米粉重量一致，如表1所示。

表1 發(fā)酵底物組成Table 1 Composition of fermentation substrate g

1.2 體外發(fā)酵試驗

以3只安裝永久性瘤胃瘺管的湘東黑山羊為瘤胃液供體動物，試驗山羊飼喂精料和稻草混合的飼糧，飼糧精粗比為40∶60，自由飲水。晨飼前通過瘤胃瘺管采集新鮮瘤胃液，迅速裝入提前充滿二氧化碳的保溫瓶并帶回實驗室，經(jīng)過6層脫脂紗布進(jìn)行過濾，隨后將過濾后的瘤胃液置于39.5 ℃恒溫水浴鍋且不斷通入純二氧化碳保持厭氧狀態(tài)。稱取0.6 g發(fā)酵底物至135 mL厭氧發(fā)酵瓶中，然后在39.5 ℃條件下，加入12 mL瘤胃液和48 mL人工瘤胃緩沖液[16]。根據(jù)Wang等[17]的流程，利用全自動化體外培養(yǎng)系統(tǒng)開展體外發(fā)酵試驗。發(fā)酵瓶通過導(dǎo)管與三通電磁閥和壓力傳感器連接。壓力傳感器與計算機(jī)連接，能夠?qū)崟r監(jiān)測記錄發(fā)酵瓶中的壓力，并通過壓力與氣體體積間關(guān)系計算氣體生成量[18]。當(dāng)厭氧瓶中壓力超過9 kPa，電磁閥打開，厭氧瓶中頂部空間的氣體釋放并進(jìn)入氣相色譜儀(安捷倫7890A，安捷倫公司，美國)，從而對氣體中的氫氣和甲烷產(chǎn)量進(jìn)行測定。氫氣和甲烷產(chǎn)量根據(jù)Wang等[19]的公式進(jìn)行計算。每個發(fā)酵瓶為1個平行，每次試驗的每個處理設(shè)置3個平行，重復(fù)體外發(fā)酵試驗3次，每次試驗使用來自2只不同瘺管羊的混合瘤胃液。

1.3 樣品采集與測定

體外發(fā)酵試驗48 h后終止，立即測定pH(Starter300；奧豪斯儀器有限公司，上海)。然后取2 mL的樣品在4 ℃下，12 000 r/min離心10 min，將1.5 mL的上清轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，添加0.15 mL 25%(m/v)的偏磷酸酸化，并置于-20 ℃保存過夜。樣品解凍后，4 ℃，12 000 r/min，再次離心10 min，利用氣相色譜7890 A對樣品中的揮發(fā)性脂肪酸組分進(jìn)行分析[20]。然后取1 mL樣品，參考Zhang等[21]的方法對樣品中長鏈脂肪酸比例進(jìn)行測定。最后參考Zhang等[22]的方法，計算發(fā)酵底物干物質(zhì)降解率以及每克可降解底物發(fā)酵的產(chǎn)氣量、甲烷和氫氣產(chǎn)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

根據(jù)Wang等[19-20]提出的模型，結(jié)合非線性軟件對體外模擬瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣曲線進(jìn)行擬合，并計算起始底物降解速率(FRD，×10-2/h)。利用SPSS 21.0軟件的一般線性模型程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和Duncan氏多重比較，使用正交多項式比較分析各個指標(biāo)隨亞麻籽油添加劑量的變化。P<0.05時為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同添加劑量亞麻籽油對體外瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣參數(shù)的影響

由表2可知，與對照組相比，添加亞麻籽油(≥2%)顯著降低干物質(zhì)降解率(P<0.05)，其中2%、3%、4%和5%亞麻籽油組的干物質(zhì)降解率分別降低了3.43%、5.31%、8.02%和5.70%；添加亞麻籽油(≥4%)顯著降低每克底物的產(chǎn)氣量和潛在最大產(chǎn)氣量(P<0.05)，但對每克降解底物的產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣速率和起始底物降解速率無顯著影響(P>0.05)。其中，4%和5%亞麻籽油組每克底物的產(chǎn)氣量分別降低了7.92%和12.4%，潛在最大產(chǎn)氣量分別降低了6.15%和11.00%。另外，隨著亞麻籽油添加劑量的增加，干物質(zhì)降解率、每克底物的產(chǎn)氣量、潛在最大產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣速率均呈現(xiàn)線性下降的變化趨勢。

表2 不同添加劑量亞麻籽油對體外瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣參數(shù)的影響Table 2 Effects of different supplemental levels of linseed oil on parameters of gas production in in vitro rumen fermentation

2.2 不同添加劑量亞麻籽油對體外瘤胃發(fā)酵甲烷和氫氣產(chǎn)量的影響

由表3可知，與對照組相比，添加亞麻籽油(≥2%)顯著降低每克底物的甲烷產(chǎn)量、每克降解底物的甲烷產(chǎn)量和甲烷濃度(P<0.05)。其中2%、3%、4%和5%亞麻籽油組的每克底物的甲烷產(chǎn)量分別降低了12.50%、13.50%、17.40%和23.60%，每克降解底物的甲烷產(chǎn)量分別降低了9.43%、8.62%、10.20%和18.90%，甲烷濃度分別降低了9.31%、8.79%、13.30%和18.60%。隨著亞麻籽油添加劑量的增加，每克底物的甲烷產(chǎn)量、每克降解底物的甲烷產(chǎn)量和甲烷濃度均呈現(xiàn)線性下降。與對照組相比，5%的亞麻籽油顯著降低每克底物的氫氣產(chǎn)量、每克可降解底物的氫氣產(chǎn)量和氫氣濃度(P<0.05)，分別降低了50.10%、47.00%和52.60%。隨著亞麻籽油添加劑量的增加，每克底物的氫氣產(chǎn)量、每克降解底物的氫氣產(chǎn)量和氫氣濃度均呈現(xiàn)線性下降。

表3 不同添加劑量亞麻籽油對體外瘤胃發(fā)酵甲烷和氫氣產(chǎn)量的影響Table 3 Effects of different supplemental levels of linseed oil on methane and hydrogen production in in vitro rumen fermentation

2.3 不同添加劑量亞麻籽油對體外瘤胃發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸生成和長鏈脂肪酸組成的影響

由表4可知，與對照組相比，隨著亞麻籽油添加劑量的增加，丙酸摩爾比例顯著升高(P<0.05)，總揮發(fā)性脂肪酸濃度、乙酸摩爾比例和乙丙比顯著下降(P<0.05)。

表4 不同添加劑量亞麻籽油對體外瘤胃發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸生成的影響Table 4 Effects of different supplemental levels of linseed oil on volatile fatty acid production in in vitro rumen fermentation

由表5可知，與對照組相比，亞麻籽油(≥4%)顯著降低肉豆蔻酸、棕櫚酸、十七烷酸和總的不飽和脂肪酸摩爾比例(P<0.05)，顯著增加順式油酸、亞麻酸和總不飽和脂肪酸摩爾比例(P<0.05)。

表5 不同添加劑量亞麻籽油對體外瘤胃發(fā)酵中長鏈脂肪酸組成的影響Table 5 Effects of different supplemental levels of linseed oil on long chain fatty acid profile in in vitro rumen fermentation %

3 討 論

在體外條件下，產(chǎn)氣量可以作為反映飼糧可發(fā)酵程度的重要指標(biāo)，通常產(chǎn)氣量越高，表明飼糧的可消化程度越高，也越有助于反芻家畜對飼糧的利用[23]。在本研究結(jié)果中，亞麻籽油(≥4%)顯著降低每克底物的產(chǎn)氣量和潛在最大產(chǎn)氣量。這可能是因為亞麻籽油中的亞油酸和亞麻酸具有抑菌功能，可以抑制瘤胃微生物活性[24]。有研究結(jié)果表明，亞麻籽油可以降低奶牛瘤胃內(nèi)纖維素分解菌的豐度[13]，降低瘤胃內(nèi)纖維素降解酶的活性[10]。Maia等[15]發(fā)現(xiàn)，亞麻酸不僅對纖維降解微生物區(qū)系有毒性作用，而且對體外培養(yǎng)的纖維素降解真菌(Neocallimastixfrontalis)也具有抑制作用。這也與本研究結(jié)果中干物質(zhì)降解率隨著亞麻籽油添加劑量的增加而線性降低相一致。另外，亞麻籽油對每克降解底物的產(chǎn)氣量沒有顯著影響，這說明亞麻籽油主要是通過對瘤胃微生物的毒性作用抑制飼料飼草的降解、消化和利用，使產(chǎn)氣量減少。

據(jù)報道，亞麻籽油可以降低奶牛甲烷產(chǎn)量的40.4%～64.3%[25-26]。Martin等[27]研究結(jié)果表明，在體內(nèi)條件下，亞麻籽油的添加劑量每增加1%，甲烷產(chǎn)量降低4.1%～4.8%。Szumacher-Strabel等[28]發(fā)現(xiàn)，在體外條件下，每添加1%亞麻籽油，甲烷產(chǎn)量降低10.1%。在本研究結(jié)果中，添加亞麻籽油組的甲烷產(chǎn)量降低了12.50%～23.60%。這些研究結(jié)果表明，亞麻籽油在體外抑制甲烷生成的效果明顯高于體內(nèi)，這可能是因為體內(nèi)瘤胃流通速率會明顯降低亞麻籽油在瘤胃中的滯留時間，進(jìn)而減少亞麻籽油的瘤胃生物氫化效率。另外，體外抑制甲烷生成效果之間的差異可能與亞麻籽油的來源和發(fā)酵底物不一樣所引起。

亞麻籽油主要含有十八碳不飽和脂肪酸，這些不飽和脂肪酸通過順-反異構(gòu)化反應(yīng)生成反式脂肪酸中間體，最后雙鍵加氫生成飽和脂肪酸[14]。在這個過程中，不飽和脂肪酸可以作為電子受體與甲烷菌競爭氫，從而減少甲烷生成。有研究結(jié)果表明，亞麻籽油在利用氫氣還原油酸生成硬脂酸的過程中所需要的自由能為-66 J/mol[29]，而甲烷菌利用氫氣和二氧化碳合成甲烷所需要的自由能為-16.9 J/mol[30]。與甲烷合成相比，亞麻籽油中不飽和脂肪酸生物氫化過程所需要的氫分壓更低。這說明亞麻籽油中的不飽和脂肪酸可以吸收瘤胃內(nèi)氫而成為新的氫池。這提示添加亞麻籽油會通過減少瘤胃內(nèi)氫氣產(chǎn)量，進(jìn)而降低甲烷產(chǎn)量。前期研究結(jié)果表明，瘤胃內(nèi)氫主要被甲烷菌用于甲烷合成[6]，當(dāng)甲烷生成受到抑制后，氫氣產(chǎn)量往往會顯著升高[23]，然而，在本研究結(jié)果中，亞麻籽油抑制甲烷生成的情況下，每克底物的氫氣產(chǎn)量、每克降解底物的氫氣產(chǎn)量和氫氣濃度顯著降低，這說明大部分氫氣被亞麻籽油中的不飽和脂肪酸利用。然而，在Judy等[31]的研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，增加奶牛飼糧中亞麻酸濃度，并沒有影響甲烷產(chǎn)量。這可能是因為不飽和脂肪酸生物氫化作用對甲烷的抑制作用較小，說明亞麻籽油除了作為電子受體減少甲烷生成，還有其他作用機(jī)制抑制甲烷生成。

有研究結(jié)果表明，飽和脂肪酸以及氫化處理后的植物油脂同樣會抑制甲烷產(chǎn)生[32-33]，因此亞麻籽油對甲烷的抑制作用可能是不飽和脂肪酸生物氫化與飽和脂肪酸對抑制甲烷菌共同作用導(dǎo)致的結(jié)果。在Martin等[25]試驗中，添加亞麻籽油后，飼糧中的粗脂肪含量從2.6%增加到8.4%。同樣，Martin等[26]試驗中，添加亞麻籽油后，粗脂肪含量從2.3%增加到7.6%。而在Judy等[31]的研究中，2組飼糧之間粗脂肪含量沒有顯著差異(4.50% vs 4.87%)，這也可能是僅僅提高飼糧脂肪酸含量而不改變粗脂肪含量對甲烷排放沒有顯著影響的重要原因。有研究結(jié)果表明，亞麻籽油對原蟲具有毒性作用[34]，而幾乎所有的瘤胃纖毛原蟲表面都附著有甲烷菌[34]，當(dāng)原蟲受到抑制后，甲烷菌也可能會受到抑制。另外，在Sato等[35]研究結(jié)果中，亞麻籽油會降低瘤胃產(chǎn)甲烷菌中占主導(dǎo)地位的甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)，從而使甲烷產(chǎn)量降低。

在本研究結(jié)果中，隨著亞麻籽油劑量的增加，總揮發(fā)性脂肪酸濃度、乙丙比和乙酸摩爾比例呈線性降低，而丙酸摩爾比例呈線性升高的變化趨勢。其中，總揮發(fā)性脂肪酸濃度的變化可能是與亞麻籽油抑制底物降解有關(guān)。Sato等[35]發(fā)現(xiàn)，亞麻籽油會促進(jìn)丙烯酸和琥珀酸途徑代謝產(chǎn)生丙酸。這可能是導(dǎo)致瘤胃乙丙比降低和丙酸摩爾比例升高的重要原因。有研究結(jié)果表明，亞麻籽油中不飽和脂肪酸在瘤胃內(nèi)會有60%～98%被生物氫化[36]。在本試驗中，亞麻籽油含有90%以上的十八碳不飽和脂肪酸，體外發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液中的脂肪酸主要以飽和脂肪酸為主(>85%),這說明大部分不飽和脂肪酸通過生物氫化作用，轉(zhuǎn)變成了飽和脂肪酸。但是，在本研究結(jié)果中，硬脂酸摩爾比例卻沒有顯著變化，這可能是因為本試驗測定的是長鏈脂肪酸摩爾比例而不是濃度。順式油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸摩爾比例的升高可能是與亞麻籽油中不飽和脂肪酸生物氫化不完全相關(guān)。

4 結(jié) 論

① 亞麻籽油中不飽和脂肪酸會通過生物氫化作用促進(jìn)氫的利用，從而減少甲烷產(chǎn)量。

② 亞麻籽油會抑制飼料降解。