吳成武 王偉 湯休書 張凱

(黔西南州中醫(yī)院骨傷科，貴州 興義 562400)

骨關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨損傷為主要病變的慢性關(guān)節(jié)疾病，多發(fā)生于中老年人群，嚴(yán)重危害患者健康。目前，臨床常采用非甾體抗炎藥治療骨關(guān)節(jié)炎，但其有較多副作用，如引起胃腸消化道出血、心血管疾病等〔1,2〕。研究顯示，天然植物化學(xué)物因有安全、高效、副作用較小等優(yōu)點在骨關(guān)節(jié)炎的治療中有潛在的應(yīng)用前景〔3〕。徐長卿丹皮酚是中藥徐長卿的主要活性成分之一，與非甾體抗炎藥有相似的藥理作用，有鎮(zhèn)痛、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤等功效〔4〕。研究顯示，徐長卿丹皮酚可抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡〔5〕，緩解痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎〔6〕。目前，還未有徐長卿丹皮酚影響骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞作用機制的相關(guān)報道。研究顯示，Wnt/β-catenin信號通路在調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞、維持軟骨基質(zhì)健康等方面起重要作用，與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制存在密切聯(lián)系〔7〕。本研究通過白細(xì)胞介素(IL)-1β誘導(dǎo)體外分離培養(yǎng)的大鼠軟骨細(xì)胞，探討徐長卿丹皮酚對IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞損傷的影響及其是否通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和實驗試劑 雄性SD大鼠：8周齡，質(zhì)量160～220 g，健康清潔級購自北京維通利華公司，合格證號SCXK(京)2018-0006；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自美國Sigma公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒購自北京索萊寶公司；酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3、酶切caspase-9、Wnt和β-catenin抗體均購自美國Cell Signaling公司；基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-3、MMP-9和MMP-13抗體均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司；性別決定區(qū)Y框蛋白(SOX)-9和二型膠原蛋白(Col-Ⅱ)抗體均購自美國Santa Cruz公司；干擾素(IFN)-γ、IL-6和IL-8試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2實驗方法

1.2.1軟骨細(xì)胞分離和培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)方法分離培養(yǎng)大鼠軟骨細(xì)胞〔8〕。SD大鼠脫頸椎處死，碘伏乙醇消毒，暴露膝關(guān)節(jié)，用刀刮取表面軟骨，手術(shù)剪剪碎，加入0.25%胰蛋白酶，采用酶消化法分離培養(yǎng)軟骨細(xì)胞。原代軟骨細(xì)胞分離后，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%、濕度97%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，進(jìn)行換液處理，此后每2～3 d更換1次培養(yǎng)基。細(xì)胞融合至80%左右時，0.25%胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞分組處理 軟骨細(xì)胞分為對照(NC)組：正常培養(yǎng)24 h；IL-1β組：10 μg/L〔8〕的IL-1β作用軟骨細(xì)胞24 h；低劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組：10 μg/L的IL-1β與60 μg/ml徐長卿丹皮酚共同作用24 h；中劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組：10 μg/L的IL-1β與120 μg/ml徐長卿丹皮酚共同作用24 h；高劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組：10 μg/L的IL-1β與180 μg/ml徐長卿丹皮酚共同作用24 h；徐長卿丹皮酚+IL-1β+Wnt/β-catenin信號通路激活劑(LiCl)組：20 μmol/L〔9〕LiCl作用24 h后，10 μg/L的IL-1β與120 μg/ml徐長卿丹皮酚共同作用24 h。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 取第4代對數(shù)生長期的軟骨細(xì)胞，以每孔1×104個接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。細(xì)胞貼壁后，按照上述分組處理。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，-20℃保存?zhèn)溆?。胰酶消化?xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗。參照Annexin V-FITC/PI試劑盒操作說明，分別取各組1.0×106個細(xì)胞，加入400 μl結(jié)合緩沖液，細(xì)胞混懸后，加入10 μl Annexin V-FITC，混勻，室溫避光孵育15 min。然后再加入5 μl PI，室溫避光孵育5 min。最后再加入100 μl結(jié)合緩沖液，混勻后上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4Western印跡法檢測蛋白表達(dá) 細(xì)胞分組和處理同1.2.3。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，加入RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞中總蛋白。使用BCA對蛋白定量后，取適量蛋白，100℃煮沸5 min。蛋白變性后，以每孔30 μg蛋白行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，置于5%脫脂牛奶中進(jìn)行封閉，時間1 h。加入一抗，4℃孵育過夜。再加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗IgG，室溫孵育1 h。加入ELC顯影液，避光顯影。

1.2.5酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測IFN-γ、IL-6和IL-8水平 取1.2.3中保存的各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，3 500 r/min離心10 mim，分別參照IFN-γ、IL-6和IL-8試劑盒操作說明，檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-6和IL-8水平。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1徐長卿丹皮酚對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的影響 與NC組比較，IL-1β組軟骨細(xì)胞凋亡率、酶切caspase-3和酶切caspase-9蛋白水平均顯著升高(均P<0.05)。與IL-1β組比較，低、中、高劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組軟骨細(xì)胞凋亡率、酶切caspase-3和酶切caspase-9蛋白水平均顯著降低(均P<0.05)。與低劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組比較，中、高劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組軟骨細(xì)胞凋亡率、酶切caspase-3和酶切caspase-9蛋白水平均顯著降低(P<0.05)；而中劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組和高劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表1、圖2。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測軟骨細(xì)胞凋亡

2.2徐長卿丹皮酚對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥因子分泌的影響 與NC組比較，IL-1β組軟骨細(xì)胞IFN-γ、IL-6和IL-8水平均顯著升高(均P<0.05)。與IL-1β組比較，低、中、高劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組軟骨細(xì)胞IFN-γ、IL-6和IL-8水平均顯著降低(均P<0.05)。與低劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組比較，中、高劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組IFN-γ、IL-6、IL-8水平均顯著降低(P<0.05)；中劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組和高劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 徐長卿丹皮酚對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞IFN-γ、IL-6、IL-8及凋亡的影響

2.3中劑量徐長卿丹皮酚對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞MMP和Col-Ⅱ表達(dá)的影響 與NC組比較，IL-1β組軟骨細(xì)胞SOX-9和Col-Ⅱ表達(dá)均顯著降低(均P<0.05)，MMP-3、MMP-9和MMP-13表達(dá)均顯著升高(均P<0.05)。與IL-1β組比較，中劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組軟骨細(xì)胞SOX-9和Col-Ⅱ表達(dá)均顯著升高(均P<0.05)，MMP-3、MMP-9和MMP-13表達(dá)均顯著降低(均P<0.05)。見圖3和表2。

1～5:NL組，IL-1β組,低劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組,中劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組,高劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組圖2 Western印跡檢測軟骨細(xì)胞酶切caspase-3和酶切caspase-9蛋白的表達(dá)

1～3：NC組、IL-1β組、中劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組；圖4同圖3 Western印跡檢測軟骨細(xì)胞SOX-9、Col-Ⅱ、MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達(dá)

表2 中劑量徐長卿丹皮酚對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞Wnt-β-catenin信號通路、MMP和Col-Ⅱ表達(dá)的影響

2.4中劑量徐長卿丹皮酚對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞Wnt-β-catenin信號通路的影響 與NC組比較，IL-1β組軟骨細(xì)胞Wnt1和β-catenin蛋白表達(dá)均顯著升高(均P<0.05)。與IL-1β組比較，中劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組軟骨細(xì)胞Wnt1和β-catenin蛋白表達(dá)均顯著降低(均P<0.05)。見表2和圖4。

圖4 Western印跡檢測軟骨細(xì)胞Wnt1和β-catenin表達(dá)

2.5Wnt-β-catenin信號通路激活劑對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌的影響 與中劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組比較，徐長卿丹皮酚+IL-1β+LiCl組軟骨細(xì)胞凋亡率、酶切caspase-3和酶切caspase-9蛋白水平均顯著升高(均P<0.05)，IFN-γ、IL-6和IL-8炎性因子表達(dá)均顯著升高(均P<0.05)。見圖5和表3。

表3 Wnt-β-catenin信號通路激活劑和徐長卿丹皮酚對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡、凋亡蛋白和炎癥因子分泌的影響

圖5 Western印跡檢測軟骨細(xì)胞酶切caspase-3蛋白和酶切caspase-9蛋白的表達(dá)

2.6Wnt-β-catenin信號通路激活劑和徐長卿丹皮酚對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞MMP和ColⅡ表達(dá)的影響 與中劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組比較，徐長卿丹皮酚+IL-1β+LiCl組軟骨細(xì)胞SOX-9和Col-Ⅱ表達(dá)均顯著降低(均P<0.05)，MMP-3、MMP-9和MMP-13表達(dá)均顯著升高(均P<0.05)。見表4和圖6。

表4 Wnt-β-catenin信號通路激活劑和徐長卿丹皮酚對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞MMP和ColⅡ表達(dá)的影響

1,2：徐長卿丹皮酚+IL-1β組，徐長卿丹皮酚+IL-1β+Licl組圖6 Western印跡檢測軟骨細(xì)胞SOX-9、Col-Ⅱ、MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達(dá)

3 討 論

隨著年齡的增長，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率呈上升趨勢，對中老年人的生命健康造成極大威脅〔10〕。研究發(fā)現(xiàn)，骨關(guān)節(jié)炎涉及到軟骨、滑膜釋放炎癥介質(zhì)等過程，可導(dǎo)致MMP表達(dá)增多，最終引起軟骨細(xì)胞凋亡〔11〕。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一的一種細(xì)胞，在調(diào)節(jié)胞外基質(zhì)合成和降解、維持軟骨基質(zhì)穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮重要作用〔12〕。IL-1β是一種致炎性細(xì)胞因子，可引起軟骨細(xì)胞退變，加速骨關(guān)節(jié)炎的病理進(jìn)程〔13〕。研究顯示，徐長卿丹皮酚有抑制軟骨細(xì)胞凋亡及MMP-1表達(dá)的作用〔14〕，可治療骨關(guān)節(jié)炎，但其作用機制目前還未明確。

軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的丟失和異常重塑是骨關(guān)節(jié)炎的中心病理機制〔15〕。正常關(guān)節(jié)軟骨中，軟骨細(xì)胞的凋亡和增殖處于動態(tài)平衡。骨關(guān)節(jié)炎病變過程中，軟骨細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞外基質(zhì)降解，進(jìn)而引起關(guān)節(jié)軟骨的退行性病變〔16〕。caspase家族在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。caspase-9是caspase級聯(lián)反應(yīng)的啟動因子，而caspase-3是細(xì)胞凋亡執(zhí)行者，其活化后，細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆轉(zhuǎn)階段〔17〕。本研究說明IL-1β可加劇軟骨細(xì)胞凋亡，徐長卿丹皮酚可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡，延緩關(guān)節(jié)軟骨退變過程。

骨關(guān)節(jié)炎是一種慢性炎癥疾病，IL、IFN等炎性因子參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程，抑制軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)有助于控制或減輕骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展。正常關(guān)節(jié)中IFN-γ表達(dá)量極少，關(guān)節(jié)滑液和血清中IFN-γ表達(dá)越多，說明炎癥反應(yīng)越嚴(yán)重〔18〕。IL-1β可促進(jìn)IL-6等炎性因子的產(chǎn)生。陳亮等〔19〕研究顯示，骨關(guān)節(jié)炎患者血清中炎性因子IFN-γ、IL-6表達(dá)增加，可作為骨關(guān)節(jié)炎臨床診斷和治療的生物學(xué)指標(biāo)。本研究結(jié)果表明IL-1β可增加軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)，徐長卿丹皮酚可能通過降低軟骨細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)保護其免受損害。

骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的顯著特征是既表達(dá)Col-Ⅱ和蛋白聚糖，又表達(dá)細(xì)胞肥大分化標(biāo)記物如MMPs〔20〕。Col-Ⅱ是關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)膠原的主要結(jié)構(gòu)成分，約占膠原總量的90%。SOX-9是促進(jìn)軟骨形成因子，參與骨骼系統(tǒng)發(fā)育，可增加軟骨細(xì)胞Col-Ⅱ的合成〔21〕。MMPs參與骨關(guān)節(jié)軟骨和基質(zhì)的轉(zhuǎn)換過程。MMP-3在骨關(guān)節(jié)炎早期可降解Ⅸ型膠原，與骨關(guān)節(jié)炎早期膠原網(wǎng)絡(luò)水腫有關(guān)。MMP-9屬于明膠酶，可降解Col-Ⅱ。MMP-13是所有MMPs中最有效的Col-Ⅱ降解酶〔22〕。抑制MMP-3、MMP-9、MMP-13等表達(dá)可有效抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨的降解，為骨關(guān)節(jié)炎的治療提供了新方向。本研究結(jié)果表明徐長卿丹皮酚可通過調(diào)控SOX-9、Col-Ⅱ及MMP的表達(dá)抑制軟骨降解。

Wnt/β-catenin信號通路是一條依賴Wnt細(xì)胞外信號和β-catenin核內(nèi)信號發(fā)揮作用的信號通路，與軟骨基質(zhì)代謝、關(guān)節(jié)軟骨去分化及軟骨細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，其表達(dá)過高可促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變〔23〕。本研究結(jié)果表明Wnt/β-catenin信號通路信號通路被激活，徐長卿丹皮酚可抑制軟骨細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路的激活，徐長卿丹皮酚通過抑制Wnt/β-catenin信號通路降低IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡、炎性因子及相關(guān)MMP的表達(dá)，并促進(jìn)SOX-9和Col-Ⅱ蛋白表達(dá)，從而保護IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷。

綜上，徐長卿丹皮酚可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路保護IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷，在骨關(guān)節(jié)炎治療中有一定的應(yīng)用前景。