潘秋霞，胡鏡清

(1.戰(zhàn)略支援部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心，北京 100101；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700)

以超敏C-反應(yīng)蛋白(high sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)異常為主的炎癥反應(yīng)，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(glutamyl transpeptidase,GCT)水平升高的氧化應(yīng)激反應(yīng)，血小板(platelet,PLT)升高的凝血狀態(tài)，糖代謝異常，構(gòu)成了冠心病痰瘀互結(jié)證患者的主要病理變化[1-5]。有學(xué)者認(rèn)為，炎癥反應(yīng)是急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS)痰瘀互結(jié)證的重要病理改變之一[6]，其中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)8、MMP-9/MMPs組織抑制物3可能發(fā)揮了關(guān)鍵作用[7]。柏冬等[8]通過文獻(xiàn)梳理發(fā)現(xiàn)，有13個(gè)炎癥相關(guān)指標(biāo)可能與ACS痰瘀互結(jié)證相關(guān)，包括①CRP、hs-CRP；②同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)；③細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素6(IL-6)、IL-18、MMPS、單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein,MCP-1)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子；④免疫細(xì)胞膜分子，如細(xì)胞間黏附分子1、分化抗原與分化抗原40配體、P選擇素與P選擇素糖蛋白配體1；⑤脂蛋白(Apo A-Ⅰ、α1-AT)。

為闡明炎性細(xì)胞因子在ACS痰瘀互結(jié)證患者外周血中的特異性表達(dá)，本研究對(duì)ACS痰瘀互結(jié)證患者外周血中11個(gè)炎性相關(guān)細(xì)胞因子的含量進(jìn)行檢測(cè)。

1 對(duì)象

所有志愿者的基本資料和來源于2015～2018年間胡鏡清研究員團(tuán)隊(duì)973項(xiàng)目所收集的ACS志愿者和健康志愿者。ACS志愿者分為痰瘀互結(jié)證組和非痰瘀互結(jié)證組，健康志愿者均納入健康對(duì)照組。

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)

ACS痰瘀互結(jié)證診斷與積分計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)：采用“痰濕證+血瘀證”組合形式的《冠心病痰瘀互結(jié)證宏觀診斷標(biāo)準(zhǔn)》[9]進(jìn)行痰瘀互結(jié)辨證診斷及量化積分計(jì)算。痰濕或血瘀累計(jì)賦分≥6分者則痰濕證或血瘀證成立，同時(shí)達(dá)到痰濕證、血瘀證診斷閾值時(shí)可診斷為痰瘀互結(jié)證。為保證納入樣本的高質(zhì)量及代表性，所有入組病例均為在連續(xù)3次隨訪中無證候演變及轉(zhuǎn)化的患者。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

ACS的納入標(biāo)準(zhǔn)：患者年齡35～85歲；符合WHO急性冠脈綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)；西醫(yī)診斷為不穩(wěn)定心絞痛或非ST段抬高型心肌梗死患者；簽署知情同意書并自愿參加本研究者；預(yù)計(jì)1年內(nèi)能堅(jiān)持隨訪。健康受試者納入標(biāo)準(zhǔn)：受試者年齡35～85歲；體檢健康且中醫(yī)體質(zhì)測(cè)評(píng)被判定為陰陽(yáng)平和體質(zhì)志愿者；簽署知情同意書并自愿參加本研究者。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

急性冠脈綜合征患者排除標(biāo)準(zhǔn)：近1個(gè)月內(nèi)感染、發(fā)熱、創(chuàng)傷、燒傷、手術(shù)史；活動(dòng)性結(jié)核病或風(fēng)濕免疫疾病患者；重度心律失常(快速房顫、房撲、陣發(fā)性室速等)伴血流動(dòng)力學(xué)改變者；慢性心力衰竭階段C患者(階段C指臨床心衰階段，患者已有基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)性心臟病，以往或目前有氣短、乏力、運(yùn)動(dòng)耐量下降等心衰的癥狀或體征)；心臟瓣膜(1個(gè)瓣膜及以上發(fā)生中度病變)或原發(fā)性心肌??；合并腦血管病急性期或亞急性期的患者；胃腸道手術(shù)或器質(zhì)性疾病病史；慢性阻塞性肺疾病急性加重期或肺心病或呼吸衰竭患者；已知的腎功能不全，血清肌酐(creatinine,Cr)男性>221 μmol/L，女性>177 μmol/L者；已知肝功能不全者，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)大于正常值3倍或合并肝硬化者；合并造血系統(tǒng)或惡性腫瘤等嚴(yán)重原發(fā)性疾病；臟器移植患者；嚴(yán)重的精神障礙患者(感知障礙、思維障礙)；孕婦、哺乳期婦女；研究者認(rèn)為存在不適合參加該試驗(yàn)其他情況。

健康志愿者排除標(biāo)準(zhǔn)：近1個(gè)月內(nèi)感染、發(fā)熱、創(chuàng)傷、燒傷、手術(shù)史；活動(dòng)性結(jié)核病或風(fēng)濕免疫疾病患者；腦血管病患者；心臟瓣膜(1個(gè)瓣膜及以上發(fā)生中度病變)或原發(fā)性心肌??；慢性阻塞性肺疾病急性加重期或肺心病或呼吸衰竭患者；已知腎功能不全，Cr男性>221 μmol/L，女性>177 μmol/L者；已知肝功能不全者，ALT大于正常值的3倍或合并肝硬化者；合并造血系統(tǒng)或惡性腫瘤等嚴(yán)重原發(fā)性疾病；臟器移植患者；嚴(yán)重的精神障礙患者(感知障礙、思維障礙)；孕婦、哺乳期婦女；研究者認(rèn)為存在不適合參加該試驗(yàn)的其他情況。

2 方法

2.1 樣本收集

血液樣本均為志愿者上午7～9時(shí)的空腹靜脈血(志愿者均被告知采血前24 h內(nèi)避免運(yùn)動(dòng)、飲酒，飲食習(xí)慣和睡眠習(xí)慣改變)2～5 mL，離心后分類凍存于-80 ℃。

2.2 樣本檢測(cè)

所選血清樣品于4 ℃水浴解凍和離心待檢，抗體選用Merck公司生產(chǎn)的MILLIPLEX抗體。采用懸液芯片檢測(cè)儀及Luminex200TM檢測(cè)及分析結(jié)果，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

表1示，本研究應(yīng)用的證候數(shù)據(jù)均來自于課題組前期的流行病學(xué)調(diào)查資料。經(jīng)過兩輪數(shù)據(jù)清洗和嚴(yán)格的信息篩選，納入質(zhì)量合格的血清樣本。本研究中，共納入ACS痰瘀互結(jié)證患者10例，ACS非痰瘀互結(jié)證患者13例，健康志愿者12人。各組患者的年齡、性別、身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)等情況比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組一般情況比較

3.1 血清IL-2、IL-12、IL-13、IL-17、MIP-1水平檢測(cè)結(jié)果

表2示，與健康對(duì)照組比較，在痰瘀互結(jié)證患者外周血中IL-2、IL-12、IL-13、IL-17水平顯著升高(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.05)，且痰瘀互結(jié)證組患者外周血中IL-2、IL-12、IL-13、IL-17含量也明顯高于非痰非瘀證組(P<0.01,P<0.01,P<0.05,P<0.01)。與健康對(duì)照組比較，巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1(MP-1)在痰瘀互結(jié)證組的含量明顯升高(P<0.05)，非痰瘀互結(jié)證組MIP-1含量明顯降低(P<0.05)，且痰瘀互結(jié)證組的MIP-1水平顯著高于非痰瘀互結(jié)證組(P<0.01)。

表2 3組血清IL-13、IL-12、IL-2、IL-17、MIP-1水平比較

3.2 血清IL-1β、IL-37水平檢測(cè)結(jié)果

表3示，與健康對(duì)照組和痰瘀互結(jié)證組比較，非痰瘀互結(jié)證組IL-1β含量顯著低(P<0.01,P<0.01)；健康對(duì)照組和痰瘀互結(jié)證組IL-1β含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。痰瘀互結(jié)證組的IL-37水平顯著低于非痰非瘀證組(P<0.01)，但痰瘀互結(jié)證組IL-37的含量與健康對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 3組血清IL-1β、IL-37水平比較

3.3 血清CCL5、IL-18、IL-8、MCP-1水平檢測(cè)結(jié)果

表4示，與健康對(duì)照組比較，痰瘀互結(jié)證組和非痰瘀互結(jié)證組CCL5的含量均顯著降低(P<0.01,P<0.01)，但痰瘀互結(jié)證組和非痰瘀互結(jié)證組CCL5含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與健康對(duì)照組比較，痰瘀互結(jié)證組和非痰瘀互結(jié)證組IL-18含量均明顯升高(P<0.01,P<0.05)，但痰瘀互結(jié)證組和非痰瘀互結(jié)證組IL-18含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，外周血中IL-8、MCP-1的含量在各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 3組血清CCL5、IL-18、IL-8、MCP-1水平比較

4 討論

炎癥反應(yīng)是冠心病的關(guān)鍵病理基礎(chǔ)之一。而炎性細(xì)胞因子聚集所形成的“炎性負(fù)荷”是ACS患者發(fā)生斑塊破裂、造成不良心血管結(jié)局的主要原因之一[10-13]。痰瘀互結(jié)證是ACS的主要證候之一。既往研究認(rèn)為，與機(jī)體炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的hs-CRP在痰瘀互結(jié)證患者外周血表達(dá)明顯升高[14]。因此，挖掘痰瘀互結(jié)證患者的外周血中差異表達(dá)的炎性細(xì)胞因子，對(duì)今后ACS痰瘀互結(jié)證的潛在分子標(biāo)志物研究與臨床辨證用藥具有重要的參考價(jià)值。

IL-2、IL-12、MIP-1都是促炎性的細(xì)胞因子。IL-2、IL-12、MIP-1在ACS痰瘀互結(jié)證患者外周血清中含量明顯高于健康對(duì)照組和非痰瘀互結(jié)證組。IL-2能刺激自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞的增殖和殺傷活性，誘導(dǎo)淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(lympholine activated killer cell,LAK細(xì)胞)產(chǎn)生，并能促進(jìn)B細(xì)胞增殖和分泌抗體、激活巨噬細(xì)胞[15]。IL-12能誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-g(IFN-g)，促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，也可以誘導(dǎo)促進(jìn)IFN-γ、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GC-SF)、IL-2Rα等產(chǎn)生[16]，還能協(xié)同IL-2促進(jìn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和LAK細(xì)胞的產(chǎn)生，與冠心病的病情程度關(guān)系密切[17-19]。MIP-1能激活粒細(xì)胞，誘導(dǎo)NK細(xì)胞增殖與活化，發(fā)揮趨化和促進(jìn)炎癥的生物學(xué)作用，還與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊病變嚴(yán)重程度及斑塊穩(wěn)定性明顯相關(guān)[20-23]。IL-2、IL-12、MIP-1的表達(dá)增加，意味著ACS痰瘀互結(jié)證患者體內(nèi)巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞參與形成的“炎性負(fù)荷”加重，而且IL-2、IL-12、MIP-1表達(dá)增加與ACS痰瘀互結(jié)證密切相關(guān)。

IL-13在ACS痰瘀互結(jié)證患者外周血清中的含量明顯高于健康對(duì)照組和非痰瘀互結(jié)證組。IL-13是一種抑炎性細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖及合成IgE類抗體，增強(qiáng)B細(xì)胞表面MHCⅡ類分子、CD23及CD72的表達(dá)，協(xié)同IL-2刺激NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN，從而促進(jìn)單核-巨噬細(xì)胞活化和Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)[24，25]。我們推測(cè)，IL-13的高表達(dá)可能為機(jī)體“炎性負(fù)荷”加重的負(fù)反饋，IL-13的表達(dá)也與ACS痰瘀互結(jié)證關(guān)系密切。

IL-17的含量在ACS痰瘀互結(jié)證患者外周血清中的含量明顯高于健康對(duì)照組和非痰瘀互結(jié)證組。IL-17是Th17細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的早期啟動(dòng)因子，通過促進(jìn)釋放促炎性細(xì)胞因子以放大炎癥反應(yīng)；IL-17與受體結(jié)合后，可通過MAP激酶途徑和核因子κB(NF-κB)途徑，介導(dǎo)中性粒細(xì)胞動(dòng)員的興奮過程[26，27]，導(dǎo)致炎癥的產(chǎn)生[28，29]。但諸多研究表明，IL-17的高表達(dá)與血瘀證的發(fā)生關(guān)系密切，且活血化瘀藥物能明顯降低關(guān)節(jié)液中IL-17的含量[30-33]。因此我們推測(cè)，IL-17的表達(dá)可能與痰瘀互結(jié)證或血瘀證中的“瘀”關(guān)系更為密切。

CCL5和IL-8均為促炎性的細(xì)胞因子。與健康對(duì)照組比較，痰瘀互結(jié)證組和非痰瘀互結(jié)證組中CCL5的表達(dá)均顯著降低，IL-18的表達(dá)均明顯升高；但CCL5和IL-18含量在瘀互結(jié)證組與非痰瘀互結(jié)證組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。目前尚未發(fā)現(xiàn)，CCL5和IL-18與ACS痰瘀互結(jié)證有明顯的相關(guān)性，我們推測(cè)CCL5的低表達(dá)和IL-18的高表達(dá)可能只與ACS疾病本身相關(guān)。

綜上所述，炎癥反應(yīng)是ACS痰瘀互結(jié)證的重要病理改變。高表達(dá)的IL-12、IL-2、MIP-1、IL-13與ACS痰瘀互結(jié)證密切相關(guān)，IL-17的高表達(dá)可能與痰瘀互結(jié)證或血瘀證中的“瘀”關(guān)系更為密切。