于德水 張曉艷

結(jié)直腸癌(CRC)發(fā)病率在所有惡性腫瘤中位列第三[1]。超過50%的結(jié)直腸癌患者最終會發(fā)展成遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者治療失敗以及死亡的主要原因[2]。大量研究表明，lncRNAs參與調(diào)節(jié)腫瘤的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為[3]。lnc-RNA 可作為內(nèi)源競爭性 RNA(ceRNAs)或發(fā)揮miRNA海綿作用，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)miRNA下游靶蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)或抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。其中，lncRNA-HCG11在肝癌和乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移相關(guān)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-144-3p在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、骨髓瘤、肺腺癌、食管癌、前列腺癌等中發(fā)揮抑癌基因的作用，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[5]。富含脯氨酸蛋白(proline-rich protein 11，PRR11)是近年發(fā)現(xiàn)的一個與腫瘤發(fā)生發(fā)展均密切相關(guān)的新基因，在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌以及卵巢癌等多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲、遷移以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等惡性生物學(xué)行為[6]。并且，在胰腺癌中，miR-144-3p靶向下調(diào)PRR11表達(dá)，抑制胰腺癌細(xì)胞PANC-1的增殖。本研究旨在探討lncRNA-HCG11通過調(diào)控miR-144-3p/PRP11分子軸參與結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找結(jié)直腸癌中調(diào)控癌細(xì)胞增殖遷移的新靶點和標(biāo)志分子，為診斷和預(yù)后提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與耗材

人結(jié)直腸癌細(xì)胞株(HCT116、SW480、Lovo)和人正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞NCM460均購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞庫。PMI-DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗(鏈霉素，青霉素)及胰酶均購自Gibco公司；Transwell小室購自Corning公司；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒均購自Invitrogen 公司；雙熒光素報告基因試劑盒購自O(shè)mega 公司；miR-144-3p mimic/inhibitor/scramble及實驗用到的siRNAs和引物序列由TransGen生物科技公司合成；SYBR Green q-PCR Master Mix試劑盒購自Sigma公司；HCG11、PRP11的過表達(dá)質(zhì)粒購自上海吉凱生物公司；質(zhì)粒提取試劑盒、RIPA裂解液、CCK-8試劑盒、ECL 發(fā)光試劑盒均購自碧云天生物科技公司；Western blot一抗(antibody-GADPH，antibody-PRP11)和二抗(羊抗兔)購自CST公司；自動酶標(biāo)儀購自BIO-BRAD公司；電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

人結(jié)直腸癌細(xì)胞株(HT29、LOVO、Lovo)用10%FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞分為si-HCG11組；pcDNA-HCG11組；miR-144-3p mimic組；pcDNA-PRP11組；pcDNA-lnc-HCG11+miR-148a-3p mimic組；miR-148a-3p mimic+pcDNA-PRP11組；si-lnc-HCG11+pcDNA-PRP11組。每組轉(zhuǎn)染實驗組設(shè)置NC對照。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

選取對數(shù)生長期的結(jié)直腸癌細(xì)胞，胰酶消化，用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整密度至1×105個/ml。接種到6孔板，每孔加2 ml細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h，按照1.2中的分組設(shè)置，采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染，48 h后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.4 qPCR檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞中HCG11和miR-144-3p的表達(dá)

Trizol 試劑提取人結(jié)直腸癌細(xì)胞株的總RNA，DNA酶處理后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。取2 μl cDNA產(chǎn)物放入EP 管，采用SYBR Green Master Mix反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系總體積為 20 μl，反應(yīng)條件為：95 °C 預(yù)變性 30 s，95 °C 變性 5 s、60 °C 退火、72 ℃ 延伸30 s，共循環(huán) 40 次。采用U6作內(nèi)參，檢測各組細(xì)胞HCG11和miR-144-3p相對表達(dá)。測定模板的Ct值，循環(huán)數(shù)法(2-ΔΔCt)定量相對表達(dá)量。見表1。

表1 PCR引物序列

1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖活力

胰酶消化對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，96孔板接種細(xì)胞，接種量1×104個/孔，每組 設(shè)置3個復(fù)孔，每孔加100 μl培養(yǎng)基，分別在24 h、48 h、72 h、96 h后，更換新鮮培養(yǎng)基。檢測前每孔加入20 μl CCK-8試劑，孵育1 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光值(D450)，繪制細(xì)胞增殖曲線圖。相同條件下實驗重復(fù)3次。

1.6 Western blotting檢測細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)

收集細(xì)胞，用含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液裂解細(xì)胞，用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度。50 μg/孔上樣，10% SDS-PAGE凝膠分離1 h，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的PBS緩沖液封閉1 h，加入一抗，4 ℃過夜，PBST緩沖液漂洗3次，5 min/次，加入二抗，37 ℃ 孵育4 h。PBST緩沖液漂洗3次，加入ECL顯影，再洗膜3次。使用 ECL 蛋白質(zhì)印跡試劑盒顯色。GAPDH用作內(nèi)參，蛋白凝膠成像系統(tǒng)分析樣品中目標(biāo)蛋白的相對含量。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.7 Transwell實驗檢測細(xì)胞的侵襲和遷移能力

侵襲實驗中將 Matrigel 加入 Transwell 小室上室的聚碳酸酯濾膜上，37 ℃孵育15 min，使Matrigel膠凝固；遷移實驗則無需 Matrigel 基質(zhì)膠。將細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，用無血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞密度為1×105個/ml。在Transwell小室24孔板中，每孔上室加入200 μl細(xì)胞懸液，下室加入600 μl完全培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h，用棉簽拭去小室上方未穿膜的細(xì)胞，PBS上下沖洗2遍，膜下細(xì)胞用5%的多聚甲醛固定，0.5% 結(jié)晶紫溶液染色 10 min，顯微鏡下隨機(jī)選取10個視野檢查(200×)，對細(xì)胞進(jìn)行記數(shù)。相同實驗條件下重復(fù)3次。

1.8 雙熒光素酶報告基因檢測lncRNA-HCG11與miR-144-3p、miR-144-3p與PRP11的相互作用

將lnc-HCG11與miR-144-3p、miR-144-3p與PRP11結(jié)合部位的序列及其突變體序列插入Firefly熒光素酶報告基因下游，構(gòu)建表達(dá)載體。將miR-144-3p mimics與pGL4-HCG11-WT/MUT或pGL4-PRP11-WT/MUT共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞。對照組用miR-144-3p scramble與pGL4-HCG11-WT/MUT或pGL4-PRP11-WT/MUT共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染實驗完成后，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h。裂解細(xì)胞，測熒光強(qiáng)度。Renilla熒光值作為內(nèi)參。RUL值=Firefly luciferase RLU值/Renilla luciferase RUL值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗結(jié)果用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0分析，多組比較和兩組間比較分別采用單因素方差分析和t檢驗，用GraphPad Prism 7對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行圖片繪制。P<0.05或P<0.01表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌和正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-HCG11的表達(dá)水平

qRT-PCR的檢測結(jié)果表明，與正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞NCM460相比，lncRNA-HCG11在3種結(jié)直腸癌細(xì)胞株(HCT116、SW480、Lovo)中的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01或P<0.001，圖1)。3種結(jié)直腸癌細(xì)胞中，lncRNA-HCG11在Lovo中的表達(dá)水平最高(P<0.05或P<0.01，圖1)。后續(xù)實驗選取lncRNA-HCG11高表達(dá)的Lovo細(xì)胞。

注：與NCM460比較，**P<0.01，***P<0.001，與Lovo相比，#P<0.05，##P<0.01。

2.2 lncRNA-HCG11對結(jié)直腸癌細(xì)胞Lovo生物學(xué)行為的影響

qRT-PCR檢測結(jié)果表明，與對照組相比，敲降lncRNA-HCG11，Lovo細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-HCG11的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01，圖2A)；過表達(dá)lncRNA-HCG11，Lovo細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-HCG11的表達(dá)水平明顯著升高(P<0.001，圖2A)；CCK-8實驗結(jié)果表明，敲降lncRNA-HCG11顯著抑制Lovo細(xì)胞增殖活力(P<0.05或P<0.01，圖2B)。Transwell實驗結(jié)果表明，敲降lncRNA-HCG11，Lovo細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)顯著低于對照組(P<0.01，圖2C-F)。而過表達(dá)lncRNA-HCG11，在CCK-8實驗和Transwell實驗中都得到相反的結(jié)果(P<0.05或P<0.01，圖2B-F)。因此，敲降lncRNA-HCG11可抑制Lovo細(xì)胞的增殖侵襲和遷移；過表達(dá)lncRNA-HCG11則促進(jìn)Lovo細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

注：與NC組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.3 lncRNA-HCG11調(diào)控miR-144-3p的表達(dá)

starBase數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果表明，miR-144-3p可能是lncRNA-HCG11的靶基因(圖3A)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-144-3p mimics，lnc-HCG11野生型載體組HEK293T細(xì)胞的熒光強(qiáng)度與對照組相比顯著降低(P<0.01，圖3B)，而lncRNA-HCG11突變型載體組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度與對照組無顯著差異(圖3B)。這表明lncRNA-HCG11與miR-144-3p 靶向結(jié)合。同時，qRT-PCR定量結(jié)果表明，與對照組相比，敲降lncRNA-HCG11，Lovo細(xì)胞中miR-128-3p的表達(dá)水平明顯升高(P<0.001，圖3C)。由此可知，lncRNA-HCG11對miR-144-3p具有負(fù)調(diào)控作用。

注：與 NC 組比較，**P<0.01，***P<0.001。

2.4 miR-144-3p對結(jié)直腸癌細(xì)胞Lovo生物學(xué)行為的影響

qRT-PCR檢測結(jié)果表明，與對照組相比，過表達(dá)miR-144-3p，Lovo細(xì)胞中miR-144-3p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.001，圖4A)；CCK-8實驗結(jié)果表明，過表達(dá)miR-144-3p顯著抑制Lovo細(xì)胞增殖活力(P<0.05或P<0.01，圖4B)；Transwell實驗結(jié)果表明，過表達(dá)miR-144-3p，Lovo細(xì)胞的侵襲和遷移能力與對照組相比顯著降低(P<0.01，圖C-F)。而轉(zhuǎn)染miR-144-3p inhibitor顯著降低miR-144-3p表達(dá)(P<0.01，圖4A)；在CCK-8實驗和Transwell實驗中都得到相反的結(jié)果(P<0.05或P<0.01，圖B-F)。因此，過表達(dá)miR-144-3p顯著抑制Lovo細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移；抑制miR-144-3p表達(dá)能顯著促進(jìn)Lovo細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。

注：與 NC組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.5 miR-144-3p對PRP11表達(dá)的調(diào)控作用

starBase數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果表明，PRP11可能是miR-144-3p的靶基因(圖5A)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-144-3p mimics，PRP11野生型載體組HEK293T細(xì)胞的熒光素酶活性顯著下降(P<0.01，圖5B)，而miR-144-3p mimics與PRP11突變型載體共轉(zhuǎn)染，HEK293T細(xì)胞的熒光素酶活性與對照組相比無顯著差異(圖5B)。同時，Western blotting檢測結(jié)果表明，過表達(dá)miR-144-3p，Lovo細(xì)胞中PRP11的表達(dá)水平顯著下降(P<0.01，圖5C)。這表明，miR-144-3p負(fù)調(diào)控PRP11的表達(dá)。

注：與正常對照組比較，** P<0.01。

2.6 lncRNA-HCG11通過miR-144-3p/PRP11分子軸對結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

Western blot檢測結(jié)果表明，過表達(dá)PRP11，Lovo細(xì)胞中PRP11表達(dá)水平明顯高于對照組(P<0.001，圖6A)；CCK-8檢測結(jié)果表明，與對照組相比，過表達(dá)PRP11顯著促進(jìn) Lovo細(xì)胞的增殖活力(P<0.05或P<0.01，圖6B)。Transwell實驗表明，與對照組相比，過表達(dá)PRP11組Lovo細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.01，圖6C-D)?；貜?fù)實驗中，同時轉(zhuǎn)染pcDNA-lnc-HCG11+miR-148a-3p mimic，miR-148a-3p mimic+pcDNA-PRP11，si-lnc-HCG11+pcDNA-PRP11，顯著恢復(fù)了Lovo細(xì)胞中PRP11的表達(dá)水平(P<0.01，圖6A)。CCK-8和Transwell實驗檢測結(jié)果分別表明，lnc-HCG11通過下調(diào)miR-144-3p對PRP11的抑制作用，促進(jìn)Lovo細(xì)胞增殖、侵襲和遷移(P<0.05或P<0.01，圖6B-D)。由此可知，lnc-HCG11與PRP11競爭結(jié)合miR-144-3p，促進(jìn)Lovo細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。

a：NC組；b：pcDNA-PRP11組；c：miR-144-3p模擬+pcDNA-PRP11組；d：si-lnc-HCG11+pcDNA-PRP11組；e：miR-144-3p模擬+pcDNA-PRP11組。與a組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與b組比較，#P<0.01。

3 討論

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見的消化道惡性腫瘤之一，在我國的發(fā)病率呈上升趨勢。結(jié)直腸癌患者的5年存活率與腫瘤細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移程度負(fù)相關(guān)。近年來結(jié)腸癌的診斷和治療雖然在一定程度上降低了患者死亡率，但侵襲、轉(zhuǎn)移仍是導(dǎo)致結(jié)腸癌患者預(yù)后差和治療失敗的主要原因[7]。因此，深入研究結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機(jī)制，對患者的診斷和預(yù)后有重要意義。大量研究證實，lncRNA在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用，已發(fā)現(xiàn)多個lncRNA與結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)[8]。例如，He等發(fā)現(xiàn)，lncRNA-CCAT1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，在結(jié)腸癌細(xì)胞SW620中過表達(dá)CCAT1可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲[9]。Lu等發(fā)現(xiàn)，lncRNA-PANDAR在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著高于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞，在體外實驗中，敲降lncRNA-PANDAR顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長、遷移和侵襲。Xu等發(fā)現(xiàn)，lncRNA-MALAT1在結(jié)腸癌細(xì)胞HT29中，表達(dá)上調(diào)，沉默lncRNA-MALAT1顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-HCG11在3株結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞；敲降lncRNA-HCG11顯著抑制腸癌細(xì)胞Lovo的增殖、侵襲和遷移能力；雙熒光基因報告實驗表明，lncRNA-HCG11負(fù)調(diào)控miR-148a-3p。

研究證實，miRNAs可與靶基因mRNA 3'端非翻譯區(qū)結(jié)合，促進(jìn)靶基因mRNA降解或者抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)其下游靶基因的表達(dá)，從而發(fā)揮促癌或抑癌基因的作用。有研究報道，miR-144-3p在多種腫瘤中異常表達(dá)，并參與調(diào)控腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。其中，HCMV陽性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中，miR-144-3p 通過靶向下調(diào)TOP2A的表達(dá)，抑制HCMV陽性膠質(zhì)瘤的體外增殖、克隆形成和侵襲[11]；前列腺癌細(xì)胞中，miR-144-3p 通過靶向下調(diào)CEP55的表達(dá)，抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-144-3p顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞Lovo的增殖、侵襲和遷移；進(jìn)一步實驗表明miR-128-3p靶向負(fù)調(diào)控PRP11的表達(dá)。

PRP11是近年發(fā)現(xiàn)的與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的調(diào)節(jié)分子，PRP11參與細(xì)胞周期的調(diào)控，可能通過推動細(xì)胞的S期向G2/M期轉(zhuǎn)換，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。研究表明，PRP11在胃癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)，與患者的不良預(yù)后相關(guān)[12]。雖然已證實PRP11參與細(xì)胞周期調(diào)控，但其涉及的分子機(jī)制仍然未知。目前為止，PRR11 在結(jié)直腸癌中的相關(guān)研究尚未報道。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)PRP11可能是 miR-144-3p的靶基因，并且，miR-144-3p與lnc-HCG11的位點也可以結(jié)合PRP11。基于以上，我們以內(nèi)源競爭內(nèi)源性 RNA理論為基礎(chǔ)，探討了lnc-HCG11通過miR-144-3p/PRP11分子軸對結(jié)直腸癌細(xì)胞Lovo增殖侵襲和遷移的調(diào)控作用。

本研究結(jié)果表明，HCG11在結(jié)直腸癌細(xì)胞系Lovo中表達(dá)水平顯著高于正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞，LncRNA-HCG11通過與PRP11競爭結(jié)合miR-144-3p，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞Lovo的增殖和遷移。