胡佳楠， 姜 輝， 李美琦， 朱 俐， 駱倩倩

(南通大學(xué)特種醫(yī)學(xué)研究院低氧生物醫(yī)學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南通 226019)

我國高原面積廣闊，具有極其重要的國防和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。隨著中國綜合國力的增強(qiáng)，大量平原人正逐漸進(jìn)駐高原，參與當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)建設(shè)、科學(xué)探險(xiǎn)和國防建設(shè)等活動(dòng)。然而初到高原易產(chǎn)生各種不適，嚴(yán)重時(shí)可引起組織臟器病理改變?cè)斐蓹C(jī)體損傷甚至死亡[1-3]。低壓低氧是高原環(huán)境的主要特征之一，機(jī)體為了適應(yīng)低氧環(huán)境，通過增加紅細(xì)胞數(shù)量促進(jìn)氧氣的傳輸來抵御低氧環(huán)境。而紅細(xì)胞中的血紅蛋白是保證氧氣運(yùn)輸?shù)闹匾d體。血紅蛋白的生成過程需要大量鐵元素參與[4-6]，機(jī)體中約70%的鐵存儲(chǔ)在紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白中。脾臟是回收血液衰老紅細(xì)胞中血紅素鐵重新供于機(jī)體循環(huán)利用的主要場(chǎng)所。因此，脾臟功能不僅對(duì)紅細(xì)胞的處理有直接影響，而且脾臟鐵代謝的變化更是對(duì)新的血紅蛋白的合成有重要影響。目前已很明確高原低氧可影響血清鐵含量及紅細(xì)胞生成[7，8]，但是目前有關(guān)高原低氧條件下機(jī)體脾臟組織的鐵代謝情況還不十分清楚。

本研究以健康 C57BL/6小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙模擬海拔6 000 m高原低氧環(huán)境，通過低壓低氧不同時(shí)間(12 h、3 d)與常壓常氧組比較，探討不同低氧時(shí)間后紅細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)、脾臟鐵含量及鐵代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)變化情況，旨在探討高原低氧暴露不同時(shí)間對(duì)脾臟鐵代謝及其相關(guān)指標(biāo)的影響，從紅細(xì)胞清除角度為防治高原紅細(xì)胞增多癥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙(上海塔望科技有限公司)，全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(邁瑞B(yǎng)C-5000Vet)，正置光學(xué)顯微鏡(Leica DM4000B)，生化試劑(上海生工生物科技有限公司)，組織鐵染色試劑(Sigma)，HIF-1a抗體(R&D)、TfR1抗體(Thermo)、Fpn抗體(Novusbio)、Ft-L(Abcam)抗體，HE及免疫組化試劑(碧云天生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠36只，體重(20±2.0)g，由南通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(蘇)2020-0029。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過南通大學(xué)倫理委員會(huì)審核結(jié)果。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

按體重隨機(jī)將小鼠分為四組：低壓低氧12 h組(HH-12 h)、 低壓低氧3 d組(HH- 3 d)，并設(shè)同時(shí)間點(diǎn)的常壓常氧對(duì)照(Nor-12 h和Nor-3 d)，每組9只。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙參數(shù)設(shè)定為：海拔高度6 000 m，升降速度5 m/s(穩(wěn)定后艙內(nèi)壓力顯示54 kpa，艙內(nèi)氧氣壓力 11 kpa，溫度24.9℃，濕度40%)。將HH組小鼠放置在設(shè)定好參數(shù)的低壓氧艙內(nèi)保證食物和飲用水。低壓低氧艙控制光照比大約12 h∶12 h。Nor組小鼠除了不放置在低壓低氧艙外，其他條件均與HH組小鼠一致。低壓低氧結(jié)束后從艙內(nèi)迅速取出小鼠，用10%水合氯醛麻醉后摘眼球采血，用含EDTA的EP管收集血液。最后進(jìn)行心臟灌注，分離脾臟組織待測(cè)。

1.5 紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)檢測(cè)

利用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)各組小鼠血液中紅細(xì)胞數(shù)(red blood cells, RBC)、血紅蛋白含量(hemoglobin, HGB)、紅細(xì)胞壓積(hematocrit, HCT)及平均血紅蛋白量(mean corpuscular hemoglobin, MCH)。

1.6 蘇木素伊紅染色(Hematoxylin eosin staining，HE)和鐵染色

將分離好的脾臟組織放置在4%多聚甲醛過夜固定后，進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋、切片。HE染色時(shí)用蘇木素對(duì)切片染色5 min，伊紅染色50 s，水洗后進(jìn)行脫水和透明；鐵染色時(shí)脫蠟復(fù)水后再依次放入1%亞鐵氰化鉀處理30 min，0.3% H2O2處理20 min后用DAB進(jìn)行顯色，最后用蘇木素復(fù)染5 min后水洗再脫水透明。晾干封片后于400倍顯微鏡下拍片觀察。

1.7 免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)

取脾臟的石蠟切片脫蠟、復(fù)水后抗原修復(fù)，用DAB試劑盒進(jìn)行染色，一抗4℃孵育過夜，PBS 洗3次，每次5 min；二抗室溫孵育2 h后PBS洗3次，每次5 min；最后滴加新鮮配制的DAB 顯色液顯色15 s，自來水沖洗后蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片后于400倍顯微鏡下拍片觀察。

1.8 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot, WB)

向脾臟組織中加入0.5 ml蛋白裂解液(含蛋白酶抑制劑)進(jìn)行組織勻漿；12 000 r/min離心15 min，取上清用Thermo BCA試劑盒按照說明書測(cè)定蛋白濃度。按照30 μg蛋白/樣用溴酚藍(lán)上樣緩沖液配置上樣液進(jìn)行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次5 min。二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次5 min，加入ECL 發(fā)光液后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光分析，用Image J 軟件對(duì)圖片進(jìn)行分析。所有蛋白表達(dá)量均以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 高原低氧不同時(shí)間對(duì)小鼠紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)的影響

HH-12 h與Nor-12 h組相比，小鼠血液紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、血紅蛋白量(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)無明顯變化。但隨著高原低氧暴露時(shí)間的延長，HH-3 d組小鼠RBC、HGB、HCT均明顯增高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均< 0.05)。但各時(shí)間點(diǎn)的平均血紅蛋白含量(MCH)沒有明顯變化(表1)。

Tab. 1 Erythrocyte related parameters of mice at different time points of hypobaric hypoxia n=9)

2.2 高原低氧對(duì)小鼠脾臟形態(tài)及鐵含量及分布的影響

如圖1所示，與Nor-3 d組相比，高原低氧暴露3 d后小鼠脾臟大小明顯增大，出現(xiàn)充血性腫大，HE染色顯示高原低氧3 d后脾臟的脾竇比常壓常氧小鼠變窄。組織鐵染色結(jié)果顯示，HH-3 d組與Nor-3 d組相比，脾臟紅髓脾索中非血紅素鐵含量明顯增多且分布較廣。

Fig. 1 Themorphological image, HE staining and iron staining of mice spleen

2.3 高原低氧對(duì)小鼠脾臟鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖2所示，與Nor-3 d組相比，高原低氧暴露3 d后脾臟低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(TfR1)、鐵輸出蛋白(Fpn)表達(dá)均顯著上調(diào)，儲(chǔ)鐵蛋白(Ft-L)表達(dá)顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05，表2)。圖3的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示TfR1、Fpn和Ft-L主要分布在脾臟紅髓。

Fig. 2 The expression of iron-related proteins in mice spleen

Tab. 2 Quantification of different proteins expression in mice spleen n=9)

Fig. 3 The expression and distribution of iron-related proteins in mice spleen

3 討論

關(guān)于高原低氧引起的紅細(xì)胞增多癥的病因及病理機(jī)制現(xiàn)在還不十分清楚。以往的研究更多的關(guān)注骨髓干細(xì)胞向紅細(xì)分化的過程中產(chǎn)生的一些誘導(dǎo)紅細(xì)分化的因子[9，10]，鮮少有研究關(guān)注高原低氧下RBC的清除情況。脾臟不僅是機(jī)體儲(chǔ)血器官，也對(duì)維持RBC的正常數(shù)量和結(jié)構(gòu)起重要作用，脾臟鐵代謝的變化更是對(duì)新的HGB的合成有重要影響。本研究重點(diǎn)關(guān)注高原低氧下脾臟對(duì)RBC截留及對(duì)HGB中鐵的回收情況，以此探討高原低氧下脾臟功能及鐵代謝的變化，幫助我們更好的理解高原低氧下脾臟在高原紅細(xì)胞增多癥中潛在的作用，為高原紅細(xì)胞增多癥的治療提供新的思路。

眾所周知，低氧時(shí)機(jī)體可以通過增加RBC數(shù)量及HGB含量來彌補(bǔ)全身組織氧氣供應(yīng)不足，緩解組織缺氧情況[11，12]。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在模擬急性高原6 000 m環(huán)境中暴露12 h后血液中RBC、HGB及HCT變化略有上升但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示我們?cè)诟咴脱醣┞冻跗?，脾臟作為機(jī)體血庫可向體機(jī)釋放儲(chǔ)存的血液。而暴露3 d后這些指標(biāo)均發(fā)生明顯增加，這與以往的研究報(bào)道的結(jié)果一致[13，14]。低氧誘導(dǎo)因子1α在低氧狀態(tài)下呈誘導(dǎo)型表達(dá)，因此檢測(cè)組織中HIF-1α的蛋白表達(dá)情況可以反映組織是否處于缺氧狀態(tài)。本研究中小鼠高原低氧暴露3 d后脾臟組織HIF-1α蛋白表達(dá)顯著增加，提示脾臟組織內(nèi)環(huán)境在高原低氧暴露3d后處于缺氧狀態(tài)。

本研究發(fā)現(xiàn)，高原低氧暴露3 d后小鼠脾臟大小明顯增大，這一方面是由于高原低氧暴露后RBC增加促使脾臟儲(chǔ)血增加發(fā)生代償性的充血性腫大；另一方面，高原低氧3 d引起脾臟的超負(fù)荷運(yùn)轉(zhuǎn)也可能是導(dǎo)致其腫大的另一主要原因[15]。高原低氧后機(jī)體RBC的變形能力降低，不易通過脾竇內(nèi)皮細(xì)胞間隙而滯留在脾索中[16，17]。為了清除截留的RBC會(huì)有更多的巨噬細(xì)胞募集到脾索中，其結(jié)果也容易造成脾臟體積增大。本研究鐵染色結(jié)果提示高原低氧暴露3 d組脾索中非血紅素鐵含量顯著高于常壓常氧組，也說明高原低氧后脾索中募集了大量巨噬細(xì)胞來清除脾索中截留的RBC。

巨噬細(xì)胞吞噬截留的RBC后將HGB中血紅素通過血紅素加氧酶作用代謝成鐵離子釋放到血液中，再通過與轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)結(jié)合，形成 Tf-Fe 形式后隨血液轉(zhuǎn)運(yùn)，到達(dá)靶細(xì)胞膜時(shí)與細(xì)胞膜上的TfR1結(jié)合形成復(fù)合體，被內(nèi)攝進(jìn)入胞內(nèi)后通過內(nèi)吞體膜上的金屬二價(jià)轉(zhuǎn)運(yùn)體 1將鐵釋放到細(xì)胞內(nèi)。進(jìn)入胞內(nèi)的鐵一方面被細(xì)胞利用，另一方面可通過鐵輸出蛋白(Fpn)輸出細(xì)胞，多余的鐵則被存儲(chǔ)到Ft-L上[18]。本研究中通過WB檢測(cè)脾臟組織的鐵相關(guān)蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，高原低氧12 h后鐵相關(guān)蛋白均未發(fā)生明顯變化(結(jié)果未顯示)，這與血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果中RBC、HGB、HCT均未發(fā)生明顯改變一致，提示高原低氧12 h機(jī)體還處于適應(yīng)階段，脾臟鐵代謝情況及血液系統(tǒng)均未發(fā)生明顯改變。但高原低氧暴露3 d后脾臟功能及鐵代謝情況即發(fā)生明顯改變，這些變化比急進(jìn)高原后心臟結(jié)構(gòu)功能變化的時(shí)間點(diǎn)(7 d)更早[19]。高原低氧3 d后小鼠脾臟中TfR1和Fpn表達(dá)均顯著高于常壓常氧組，說明高原低氧暴露3 d后脾臟中鐵的動(dòng)員加速，主要表現(xiàn)為鐵攝入及輸出能力提高。而Ft-L蛋白表達(dá)降低則說明高原低氧后脾臟組織中存儲(chǔ)的鐵明顯減少，這提示高原低氧后脾臟組織將自身存儲(chǔ)的鐵輸出到血液中供給循環(huán)利用以補(bǔ)償高原低氧下新的紅細(xì)胞生成對(duì)鐵的需求。進(jìn)一步的免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TfR1、Fpn及Ft-L的表達(dá)變化主要分布在脾臟紅髓中，說明高原低氧暴露3 d后在脾臟紅髓中巨噬細(xì)胞清理RBC并回收血紅素中的鐵的功能增強(qiáng)。然而高原低氧3 d的鐵染色的結(jié)果顯示被脾臟回收的鐵在脾臟紅髓發(fā)生明顯沉積。這或許是由于鐵含量太多，超出了正常生理轉(zhuǎn)運(yùn)速度。這可能會(huì)導(dǎo)致骨髓不能及時(shí)獲得從脾臟回收的鐵，引起分化的RBC中HGB功能不全或產(chǎn)生未成熟RBC數(shù)增加，隨高原低氧暴露時(shí)間延長有可能引起RBC的病理性增多，甚至發(fā)展成高原紅細(xì)胞增多癥。我們后期的研究也證實(shí)高原低氧暴露7 d的脾臟鐵代謝所有指標(biāo)(TfR1、Fpn及Ft-L)結(jié)果均與高原低氧暴露3 d的結(jié)果完全一致。這些結(jié)果提示高原3 d后血液和脾臟鐵代謝發(fā)生明顯改變且持續(xù)較長時(shí)間。目前對(duì)于更長時(shí)間(大于1周)的高原低氧暴露后小鼠血液學(xué)參數(shù)的改變，尤其是RBC方面的相關(guān)參數(shù)有較多報(bào)道，但是對(duì)于小鼠脾臟鐵代謝的變化報(bào)道較少。是否高原低氧暴露后脾臟功能異常(對(duì)紅細(xì)胞截留處理增多)是引起骨髓代償性造血增多的初始原因？是否高原低氧引起了脾臟鐵沉積使得骨髓鐵含量不足產(chǎn)生了功能不全的HGB從而引起RBC進(jìn)一步增多緩解組織缺氧，并最終形成高原紅細(xì)胞增多癥？長時(shí)間的高原低氧暴露后脾臟鐵代謝功能的持續(xù)異常(脾索持續(xù)高鐵含量暴露)是否是引起巨噬細(xì)胞功能障礙加劇高原紅細(xì)胞增多癥形成的重要原因？這些問題有待后續(xù)進(jìn)一步深入探究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)較好地用小鼠研究了模擬急進(jìn)高原3 d后血液系統(tǒng)及脾臟鐵代謝均發(fā)生明顯改變，主要表現(xiàn)為血液RBC顯著增加，脾臟截留處理RBC增多，脾索鐵沉積，脾臟組織細(xì)胞內(nèi)鐵攝取和鐵增輸出加，存儲(chǔ)鐵降低。本研究揭示了高原低氧環(huán)境下小鼠脾臟功能改變及鐵代謝異?？赡苁且鸶咴脱醣┞断录t細(xì)胞病理性增多甚至造成高原紅細(xì)胞增多癥的主要原因。