郭遠(yuǎn)盤, 史紹蓉, 徐 哲, 王 娟， 黃思敏, 萬莉莉, 雷 雄, 彭 勇

(1. 長(zhǎng)沙師范學(xué)院體育科學(xué)學(xué)院, 湖南 長(zhǎng)沙 410010; 2. 湖南師范大學(xué)體育學(xué)院, 湖南 長(zhǎng)沙 410012; 3. 湖南城市學(xué)院體育學(xué)院,益陽 413039; 4. 北京體育大學(xué)， 海淀 100084； 5. 肇慶學(xué)院體育與健康學(xué)院, 廣東 肇慶 526061; 6. 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院, 湖南 長(zhǎng)沙 410008; 7. 南京體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)健康科學(xué)系， 江蘇 南京 210014)

長(zhǎng)時(shí)間有氧運(yùn)動(dòng)可以改善心臟功能并提供心血管疾病的保護(hù)[1]。大量的研究表明，運(yùn)動(dòng)對(duì)心臟良好的適應(yīng)性變化起到了明顯的作用。心臟生理功能需要通過大量蛋白質(zhì)的表達(dá)得以完成，通過對(duì)某一個(gè)或幾個(gè)蛋白質(zhì)的研究能探索心臟某種生理功能，但如果能夠?qū)π募〉乃械鞍踪|(zhì)的表達(dá)水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)，則能從整體的角度全面反映心肌的功能狀態(tài)水平。而由于蛋白質(zhì)組(proteome)的技術(shù)具有這樣的特性，使其在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的研究中被廣泛使用[2-4]。在運(yùn)動(dòng)心臟的研究中，國(guó)外學(xué)者將該技術(shù)應(yīng)用于篩選對(duì)運(yùn)動(dòng)刺激敏感的蛋白質(zhì)并鑒定出了一大批目標(biāo)蛋白[5, 6]。國(guó)內(nèi)研究者采用不同的運(yùn)動(dòng)模型，發(fā)現(xiàn)和篩選出了熱休克蛋白β2、熱休克蛋白60、心肌肌動(dòng)蛋白α1、線粒體ATP合酶α亞基等和運(yùn)動(dòng)刺激密切相關(guān)的蛋白質(zhì)[7-13]。

中小強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)是目前公認(rèn)且專家推薦的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度。本研究通過建立長(zhǎng)期中小強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)模型，用心臟重量指數(shù)(heart weight index, HWI)評(píng)價(jià)大鼠心臟形態(tài)變化，采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法分離大鼠左心室全蛋白，結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)對(duì)左心室差異表達(dá)量有顯著變化的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，篩選出對(duì)長(zhǎng)期中小強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)刺激敏感的蛋白質(zhì)，從整體、動(dòng)態(tài)、定量的角度探討大鼠左心室肌目標(biāo)蛋白質(zhì)的差異表達(dá)極其規(guī)律，為后期進(jìn)行深入研究挑選合適的目標(biāo)蛋白并豐富運(yùn)動(dòng)健身實(shí)踐的基礎(chǔ)理論。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性2月齡SD大鼠20只，體重(232.0±8.3)g，Ⅱ級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部)。室溫20～24℃，相對(duì)濕度45%～55%，光照時(shí)間為7：00～19：00，自由飲食。大鼠按體重配對(duì)進(jìn)行分組，采用隨機(jī)數(shù)表隨機(jī)分為對(duì)照組(control, C組)和運(yùn)動(dòng)組(exercise, E組)，每組10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建模方案

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型參考Hsieh[14]運(yùn)動(dòng)動(dòng)物模型。進(jìn)行跑臺(tái)適應(yīng)性訓(xùn)練5 d，此后E組每天以速度為24 m/min訓(xùn)練40 min，負(fù)荷強(qiáng)度相當(dāng)于60%～70%VO2max，共訓(xùn)練8周。每周運(yùn)動(dòng)6 d，休息1 d。C組大鼠僅放置于跑臺(tái)上，不做實(shí)質(zhì)性運(yùn)動(dòng)。

1.3 取材

第8周末次訓(xùn)練完6 h后E組與C組同時(shí)稱重，10%水合氯醛(3 ml/100 g)麻醉后將大鼠四肢固定于解剖臺(tái)上，打開胸腔，摘取心臟，將附著于心臟上的血管和結(jié)締組織清理干凈后4℃生理鹽水沖洗，對(duì)大鼠心臟重量(heart weight，HW)進(jìn)行稱重，剪取左心室肌組織，置于液氮中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 蛋白提取

大鼠左心室肌全蛋白提取參考史紹蓉、袁愛國(guó)等蛋白提取方法[7, 15]，采用Bradford法對(duì)獲取的左心室肌蛋白樣品進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，測(cè)得C組大鼠左心室肌蛋白濃度為31.65 μg/μl，E組大鼠左心室肌蛋白濃度為32.13 μg/μl。樣品每管蛋白含量1 mg分裝后，-80℃冰箱保存待用。

1.5 固相PH梯度—SDS雙向凝膠電泳方法與圖像分析

蛋白質(zhì)固相pH梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳(2-DE)參考Gorg等[16]的方法和IPGhorTM等電聚焦系統(tǒng)操作指南進(jìn)行操作。采用改良的考馬斯亮藍(lán)染色[17]對(duì)凝膠進(jìn)行染色，采用圖像掃描儀(清華紫光D3000，中國(guó))對(duì)凝膠進(jìn)行透射掃描，采用ImageMaster 2D Platinum圖像分析軟件對(duì)所獲得的圖譜進(jìn)行分析。

1.6 質(zhì)譜鑒定分析

采用串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)篩選的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，選取一級(jí)質(zhì)譜的肽質(zhì)量指紋圖譜上峰值較高的肽段峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜鑒定，以對(duì)一級(jí)質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的確證。延遲時(shí)間提取(delayed extraction) 150 ns； 反射式模式(reflector mode)為正電荷；加速電壓(acceleration voltage)為20 000 V；Grid voltage為75%；Guide wire為0.02%；采集質(zhì)量數(shù)范圍為800～3 500 Da；基質(zhì)為肉桂酸(CHCA)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠心臟重量

大鼠心臟重量及心重指數(shù)變化顯示(表1)，與C組大鼠相比，E組大鼠HW增加了1.7%，不具有顯著性差異(P>0.05)；與C組大鼠相比，E組大鼠HWI增加了32.0%，具有顯著性差異(P<0.05)。

2.2 大鼠左心室肌2-DE結(jié)果

通過圖譜軟件分析(圖1)，E組和C組凝膠匹配率分別為(69.26±3.17)%和(67.4±2.33)%，蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)目分別是534±16個(gè)和517±18個(gè),與C組相比，E組表達(dá)量上調(diào)≥2倍或下調(diào)≥50%的蛋白質(zhì)點(diǎn)共有71個(gè)。其中，33個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)量上調(diào)，上調(diào)的倍數(shù)在2～20.5倍之間；38個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)量下調(diào)，下調(diào)的變化在50%～93.9%之間，這些蛋白質(zhì)廣泛分布于分子量15～110 kDa、等電點(diǎn)5～8之間。圖2為長(zhǎng)期中小強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)后表達(dá)量上調(diào)≥5倍或下調(diào)超過80%的蛋白質(zhì)點(diǎn)的柱狀圖，圖3為這些點(diǎn)在差異圖譜中的位置。

Fig. 1 2-DE map of left ventricular muscle protein in C group (left) and E group (right)

Tab. 1 Changes in heart weight and heart weight index n=10)

Tab. 2 Protein spots with differential expression ≥5 times after long-term moderate-small intensity aerobic exercise

Tab. 3 The differential expression of protein spots was down-regulated≥80% after long-term moderate-small intensity aerobic exercise

Tab. 4 Identification of some differential expressed protein spots by MS

Fig. 2 Histogram of protein spots with up-regulated expression ≥5 times or down-regulated≥ 80% after long-term moderate-small intensity aerobic exercise

Fig. 3 Differential map of protein expression between control group and exercise group

2.3 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

長(zhǎng)期中小強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)后有6個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)量上調(diào)≥5倍(表2)，有6個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)量下調(diào)超過80%(表3)。采用MALDI-TOF-TOF-MS技術(shù)對(duì)長(zhǎng)期中小強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后4個(gè)表達(dá)量上調(diào)≥5倍或下調(diào)≥80%的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，并在ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)獲得的肽譜和肽段氨基酸結(jié)果進(jìn)行檢索，鑒定出3個(gè)蛋白質(zhì)和1個(gè)未知蛋白(表4)。

3 討論

長(zhǎng)時(shí)間的有氧運(yùn)動(dòng)能夠使心臟的形態(tài)和功能發(fā)生改變[18]并提供心血管保護(hù)[1]，大鼠左心室肌蛋白質(zhì)的表達(dá)水平經(jīng)過長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)后發(fā)生了明顯變化。

3.1 中小強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)心臟形態(tài)學(xué)的影響

長(zhǎng)時(shí)間科學(xué)合理的運(yùn)動(dòng)能使心臟形態(tài)產(chǎn)生良好的適應(yīng)性改變，表現(xiàn)為心腔擴(kuò)大、心壁增厚等。本研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)期中小強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)后大鼠HW增加1.7%，HWI增加32.0%，HWI的增加具有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)果提示：大鼠心臟經(jīng)過長(zhǎng)期中小強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)發(fā)生了良好的適應(yīng)性改變，推測(cè)長(zhǎng)期中小強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)能有效增強(qiáng)大鼠的心肌收縮力、提高大鼠心肌泵血功能。本研究采用有氧耐力動(dòng)物模型，這一模型對(duì)心臟的影響主要以心腔的擴(kuò)大為主，心壁的增厚不明顯，因此，與C組相比，E組大鼠心臟絕對(duì)重量的增加不明顯，僅增加1.7%(P>0.05)。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中可增加對(duì)相關(guān)心功能的檢測(cè)，進(jìn)一步確證本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果。

3.2 雙向電泳圖譜分析

長(zhǎng)期中小強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)后有71個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)量上調(diào)≥2倍或下調(diào)≥50%，表達(dá)量上調(diào)≥5倍或下調(diào)≥80%的蛋白質(zhì)點(diǎn)有12個(gè)，其中有5個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)量上調(diào)超過10倍或下調(diào)超過90%，這5個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)中有3個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)量上調(diào)，2個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)量下調(diào)。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)和力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠心肌中出現(xiàn)多個(gè)缺失的蛋白質(zhì)點(diǎn)，這些點(diǎn)分布于心房肌和心室肌中[10, 11, 17]。但是在中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后缺失的蛋白質(zhì)點(diǎn)只發(fā)現(xiàn)于右心室肌，左心室肌和右心室肌未發(fā)現(xiàn)新增或缺失的蛋白質(zhì)點(diǎn)[8, 12, 15]。運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的差異可能是出現(xiàn)“缺失”蛋白質(zhì)點(diǎn)的原因，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度過大使大鼠心肌出現(xiàn)暫時(shí)性缺血缺氧或能量代謝障礙，進(jìn)而引發(fā)大鼠心肌損傷，導(dǎo)致大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后大鼠心肌蛋白質(zhì)缺失的發(fā)生。但在本研究中并未出現(xiàn)新增或缺失的蛋白質(zhì)點(diǎn)，可能和所采用的運(yùn)動(dòng)模型有關(guān)，中小強(qiáng)度的有氧運(yùn)動(dòng)單次對(duì)大鼠心臟的刺激不如力竭運(yùn)動(dòng)或者大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，這一運(yùn)動(dòng)模式對(duì)心臟的影響可能需要長(zhǎng)期反復(fù)不停的刺激，新增和缺失的點(diǎn)對(duì)心肌功能有何影響需結(jié)合蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行分析。

3.3 目標(biāo)蛋白質(zhì)的差異表達(dá)分析

通過對(duì)長(zhǎng)期中小強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后4個(gè)表達(dá)量上調(diào)≥5倍或下調(diào)≥90%的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，共鑒定出3個(gè)蛋白質(zhì)和1個(gè)未知蛋白。

3.3.1 谷胱甘肽過氧化物酶1 2222號(hào)點(diǎn)經(jīng)質(zhì)譜鑒定為谷胱甘肽過氧化物酶1(glutathione peroxidase 1,GPX-1)。GPX-1是谷胱甘肽過氧化物酶 (glutathione peroxidase，GSH-Px)家族的一員，是機(jī)體重要的抗氧化酶。

本研究E組大鼠左心室肌GSH-1表達(dá)量發(fā)生顯著變化，上調(diào)了5.2倍，與彭勇等人[19]的研究結(jié)果相反，他們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過4周中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)后大鼠心房肌谷胱甘肽合成酶下調(diào)了6.1倍，推測(cè)可能是4周運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度負(fù)荷和總量偏小，大鼠心房肌未發(fā)生強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)。本研究中經(jīng)過8周中小強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)刺激，心肌抗氧化能力增強(qiáng)，提高了心肌在運(yùn)動(dòng)條件下對(duì)活性氧自由基的清除能力，防止運(yùn)動(dòng)過程中氧自由基對(duì)心肌的損傷，降低了心臟及血管發(fā)生病變的風(fēng)險(xiǎn)，這和課題組前期[11]采用中等強(qiáng)度的有氧運(yùn)動(dòng)使右心室肌能量代謝水平提高、抗氧化能力增強(qiáng)的結(jié)果一致。因此可以推測(cè)，積累一定時(shí)間的中小強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)才能夠使心臟的的抗氧化系統(tǒng)得到加強(qiáng)，從而達(dá)到降低心臟及血管發(fā)生病變的風(fēng)險(xiǎn)。

3.3.2 β-烯醇酶 經(jīng)質(zhì)譜鑒定的1914號(hào)點(diǎn)為β-烯醇酶(beta-enolase)，也稱為肌肉特異性烯醇酶(muscle-specific enolase, MSE)，一般情況MSE在血清中維持較低水平，當(dāng)肌肉出現(xiàn)損傷時(shí)，血清中MSE含量明顯上升[20]。在診斷肌損傷和急性心肌梗死時(shí)，常將血清MSE的升高作為有力證據(jù)，也有研究認(rèn)為可將MSE作為一種預(yù)測(cè)或診斷缺血性疾病的血液標(biāo)志物[21]。

本研究中E組大鼠左心室肌MSE的表達(dá)發(fā)生了顯著變化，上調(diào)了20.5倍。以往的研究認(rèn)為長(zhǎng)期中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)能發(fā)揮心肌保護(hù)作用、增強(qiáng)心臟功能[17]。組織MSE表達(dá)水平的升高是否也提示大鼠心肌在長(zhǎng)期中小強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)后出現(xiàn)了心肌損傷？若有損傷，其機(jī)制又是如何？心肌損傷的檢測(cè)常采用心肌損傷血液標(biāo)志物、心肌缺血缺氧染色等方法[22]。后續(xù)研究中可以采用這些方法結(jié)合對(duì)血清MSE含量進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)長(zhǎng)時(shí)間中小強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后大鼠心肌損傷情況進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

3.3.3 cAMP依賴性蛋白激酶I型-α調(diào)節(jié)亞基 1895號(hào)點(diǎn)經(jīng)質(zhì)譜鑒定為cAMP依賴性蛋白激酶I型-α調(diào)節(jié)亞基(cAMP-dependent protein kinase type I-alpha regulatory subunit，PRKAR1α)，是一種蛋白激酶A( protein kinase A，PKA)調(diào)節(jié)亞基的亞單位。PRKAR1α和cAMP高度親和，是PKA最重要的調(diào)節(jié)亞基，在細(xì)胞生長(zhǎng)和分化中起重要作用[23]。PRKARⅠα的表達(dá)水平和PRKARⅡα的表達(dá)水平呈明顯的負(fù)相關(guān)，腫瘤組織的惡性增生與PRKARⅠα的過表達(dá)有關(guān)[24]。

目前尚未發(fā)現(xiàn)有研究探討PRKAR1α與運(yùn)動(dòng)的關(guān)系，更多地是從醫(yī)學(xué)角度研究PRKAR1α的表達(dá)與癌細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)展。最近的研究表明，PRKAR1α的表達(dá)水平在多原發(fā)癌和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中明顯失調(diào)，PRKAR1α是一種抑癌基因和PKA活性調(diào)節(jié)基因[25]。本研究發(fā)現(xiàn)E組PRKARⅠα表達(dá)量下調(diào)了82.8%。長(zhǎng)期中小強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)抑制了PRKARⅠα的表達(dá)，是否意味通過長(zhǎng)期中小強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)能抑制細(xì)胞的惡性增殖與分化，具有一定的抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的功能，這一觀點(diǎn)若被驗(yàn)證，或許將給癌癥早期患者的治療提供新的輔助手段。運(yùn)動(dòng)與癌癥之間研究主要集中運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)癌癥患者的康復(fù)、生活質(zhì)量影響方面，尚未發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)抑癌相關(guān)機(jī)制方面的研究，應(yīng)結(jié)合多種方法進(jìn)行綜合驗(yàn)證并探討其機(jī)制。

3.3.4 未知蛋白 本研究2148號(hào)點(diǎn)Mr為138.478 Kda，pI為5.39，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為未知蛋白。該蛋白經(jīng)過長(zhǎng)期中小強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)后表達(dá)量下調(diào)了 91.7%，發(fā)生了顯著變化。尚不清楚該蛋白屬于何種類型蛋白質(zhì)，在心肌中具有何種功能，但一定是對(duì)長(zhǎng)期中小強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)敏感的一類蛋白質(zhì)。后期可以通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討其結(jié)構(gòu)與功能，或許對(duì)補(bǔ)充長(zhǎng)期中小強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)運(yùn)動(dòng)健身和心血管康復(fù)治療有著積極的意義。

綜上所述，長(zhǎng)期中小強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)能使大鼠心臟出現(xiàn)良好的適應(yīng)性改變；大鼠左心室肌蛋白質(zhì)組發(fā)生了明顯變化。長(zhǎng)期中小強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)能有效增強(qiáng)大鼠心肌抗氧化能力。采用長(zhǎng)期中小強(qiáng)度的有氧運(yùn)動(dòng)進(jìn)行鍛煉，能有效地提高身體機(jī)能狀態(tài)，增強(qiáng)心臟機(jī)能水平，達(dá)到很好的鍛煉健身的效果。中小強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)是否也會(huì)造成心肌損傷、是否具有一定的抑癌作用？有待進(jìn)一步研究探討。