郭遠(yuǎn)盤, 史紹蓉, 徐 哲, 王 娟， 黃思敏, 萬莉莉, 雷 雄, 彭 勇

(1. 長沙師范學(xué)院體育科學(xué)學(xué)院, 湖南 長沙 410010; 2. 湖南師范大學(xué)體育學(xué)院, 湖南 長沙 410012; 3. 湖南城市學(xué)院體育學(xué)院,益陽 413039; 4. 北京體育大學(xué)， 海淀 100084； 5. 肇慶學(xué)院體育與健康學(xué)院, 廣東 肇慶 526061; 6. 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院, 湖南 長沙 410008; 7. 南京體育學(xué)院運動健康科學(xué)系， 江蘇 南京 210014)

長時間有氧運動可以改善心臟功能并提供心血管疾病的保護[1]。大量的研究表明，運動對心臟良好的適應(yīng)性變化起到了明顯的作用。心臟生理功能需要通過大量蛋白質(zhì)的表達(dá)得以完成，通過對某一個或幾個蛋白質(zhì)的研究能探索心臟某種生理功能，但如果能夠?qū)π募〉乃械鞍踪|(zhì)的表達(dá)水平進行監(jiān)測，則能從整體的角度全面反映心肌的功能狀態(tài)水平。而由于蛋白質(zhì)組(proteome)的技術(shù)具有這樣的特性，使其在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的研究中被廣泛使用[2-4]。在運動心臟的研究中，國外學(xué)者將該技術(shù)應(yīng)用于篩選對運動刺激敏感的蛋白質(zhì)并鑒定出了一大批目標(biāo)蛋白[5, 6]。國內(nèi)研究者采用不同的運動模型，發(fā)現(xiàn)和篩選出了熱休克蛋白β2、熱休克蛋白60、心肌肌動蛋白α1、線粒體ATP合酶α亞基等和運動刺激密切相關(guān)的蛋白質(zhì)[7-13]。

中小強度有氧運動是目前公認(rèn)且專家推薦的運動強度。本研究通過建立長期中小強度有氧運動模型，用心臟重量指數(shù)(heart weight index, HWI)評價大鼠心臟形態(tài)變化，采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法分離大鼠左心室全蛋白，結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)對左心室差異表達(dá)量有顯著變化的蛋白質(zhì)點進行質(zhì)譜鑒定，篩選出對長期中小強度有氧運動刺激敏感的蛋白質(zhì)，從整體、動態(tài)、定量的角度探討大鼠左心室肌目標(biāo)蛋白質(zhì)的差異表達(dá)極其規(guī)律，為后期進行深入研究挑選合適的目標(biāo)蛋白并豐富運動健身實踐的基礎(chǔ)理論。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雄性2月齡SD大鼠20只，體重(232.0±8.3)g，Ⅱ級實驗動物(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物部)。室溫20～24℃，相對濕度45%～55%，光照時間為7：00～19：00，自由飲食。大鼠按體重配對進行分組，采用隨機數(shù)表隨機分為對照組(control, C組)和運動組(exercise, E組)，每組10只。

1.2 實驗動物建模方案

實驗動物模型參考Hsieh[14]運動動物模型。進行跑臺適應(yīng)性訓(xùn)練5 d，此后E組每天以速度為24 m/min訓(xùn)練40 min，負(fù)荷強度相當(dāng)于60%～70%VO2max，共訓(xùn)練8周。每周運動6 d，休息1 d。C組大鼠僅放置于跑臺上，不做實質(zhì)性運動。

1.3 取材

第8周末次訓(xùn)練完6 h后E組與C組同時稱重，10%水合氯醛(3 ml/100 g)麻醉后將大鼠四肢固定于解剖臺上，打開胸腔，摘取心臟，將附著于心臟上的血管和結(jié)締組織清理干凈后4℃生理鹽水沖洗，對大鼠心臟重量(heart weight，HW)進行稱重，剪取左心室肌組織，置于液氮中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 蛋白提取

大鼠左心室肌全蛋白提取參考史紹蓉、袁愛國等蛋白提取方法[7, 15]，采用Bradford法對獲取的左心室肌蛋白樣品進行蛋白濃度測定，測得C組大鼠左心室肌蛋白濃度為31.65 μg/μl，E組大鼠左心室肌蛋白濃度為32.13 μg/μl。樣品每管蛋白含量1 mg分裝后，-80℃冰箱保存待用。

1.5 固相PH梯度—SDS雙向凝膠電泳方法與圖像分析

蛋白質(zhì)固相pH梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳(2-DE)參考Gorg等[16]的方法和IPGhorTM等電聚焦系統(tǒng)操作指南進行操作。采用改良的考馬斯亮藍(lán)染色[17]對凝膠進行染色，采用圖像掃描儀(清華紫光D3000，中國)對凝膠進行透射掃描，采用ImageMaster 2D Platinum圖像分析軟件對所獲得的圖譜進行分析。

1.6 質(zhì)譜鑒定分析

采用串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀對篩選的蛋白質(zhì)進行鑒定，選取一級質(zhì)譜的肽質(zhì)量指紋圖譜上峰值較高的肽段峰進行二級質(zhì)譜鑒定，以對一級質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)進行進一步的確證。延遲時間提取(delayed extraction) 150 ns； 反射式模式(reflector mode)為正電荷；加速電壓(acceleration voltage)為20 000 V；Grid voltage為75%；Guide wire為0.02%；采集質(zhì)量數(shù)范圍為800～3 500 Da；基質(zhì)為肉桂酸(CHCA)。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠心臟重量

大鼠心臟重量及心重指數(shù)變化顯示(表1)，與C組大鼠相比，E組大鼠HW增加了1.7%，不具有顯著性差異(P>0.05)；與C組大鼠相比，E組大鼠HWI增加了32.0%，具有顯著性差異(P<0.05)。

2.2 大鼠左心室肌2-DE結(jié)果

通過圖譜軟件分析(圖1)，E組和C組凝膠匹配率分別為(69.26±3.17)%和(67.4±2.33)%，蛋白質(zhì)斑點數(shù)目分別是534±16個和517±18個,與C組相比，E組表達(dá)量上調(diào)≥2倍或下調(diào)≥50%的蛋白質(zhì)點共有71個。其中，33個蛋白質(zhì)的表達(dá)量上調(diào)，上調(diào)的倍數(shù)在2～20.5倍之間；38個蛋白質(zhì)的表達(dá)量下調(diào)，下調(diào)的變化在50%～93.9%之間，這些蛋白質(zhì)廣泛分布于分子量15～110 kDa、等電點5～8之間。圖2為長期中小強度有氧運動后表達(dá)量上調(diào)≥5倍或下調(diào)超過80%的蛋白質(zhì)點的柱狀圖，圖3為這些點在差異圖譜中的位置。

Fig. 1 2-DE map of left ventricular muscle protein in C group (left) and E group (right)

Tab. 1 Changes in heart weight and heart weight index n=10)

Tab. 2 Protein spots with differential expression ≥5 times after long-term moderate-small intensity aerobic exercise

Tab. 3 The differential expression of protein spots was down-regulated≥80% after long-term moderate-small intensity aerobic exercise

Tab. 4 Identification of some differential expressed protein spots by MS

Fig. 2 Histogram of protein spots with up-regulated expression ≥5 times or down-regulated≥ 80% after long-term moderate-small intensity aerobic exercise

Fig. 3 Differential map of protein expression between control group and exercise group

2.3 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

長期中小強度有氧運動后有6個蛋白質(zhì)點的表達(dá)量上調(diào)≥5倍(表2)，有6個蛋白質(zhì)點的表達(dá)量下調(diào)超過80%(表3)。采用MALDI-TOF-TOF-MS技術(shù)對長期中小強度運動后4個表達(dá)量上調(diào)≥5倍或下調(diào)≥80%的蛋白質(zhì)點進行檢測，并在ncbi數(shù)據(jù)庫對獲得的肽譜和肽段氨基酸結(jié)果進行檢索，鑒定出3個蛋白質(zhì)和1個未知蛋白(表4)。

3 討論

長時間的有氧運動能夠使心臟的形態(tài)和功能發(fā)生改變[18]并提供心血管保護[1]，大鼠左心室肌蛋白質(zhì)的表達(dá)水平經(jīng)過長期有氧運動后發(fā)生了明顯變化。

3.1 中小強度有氧運動對心臟形態(tài)學(xué)的影響

長時間科學(xué)合理的運動能使心臟形態(tài)產(chǎn)生良好的適應(yīng)性改變，表現(xiàn)為心腔擴大、心壁增厚等。本研究結(jié)果顯示，長期中小強度有氧運動后大鼠HW增加1.7%，HWI增加32.0%，HWI的增加具有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)果提示：大鼠心臟經(jīng)過長期中小強度有氧運動發(fā)生了良好的適應(yīng)性改變，推測長期中小強度有氧運動能有效增強大鼠的心肌收縮力、提高大鼠心肌泵血功能。本研究采用有氧耐力動物模型，這一模型對心臟的影響主要以心腔的擴大為主，心壁的增厚不明顯，因此，與C組相比，E組大鼠心臟絕對重量的增加不明顯，僅增加1.7%(P>0.05)。在后續(xù)的實驗中可增加對相關(guān)心功能的檢測，進一步確證本實驗研究結(jié)果。

3.2 雙向電泳圖譜分析

長期中小強度有氧運動后有71個蛋白質(zhì)點的表達(dá)量上調(diào)≥2倍或下調(diào)≥50%，表達(dá)量上調(diào)≥5倍或下調(diào)≥80%的蛋白質(zhì)點有12個，其中有5個蛋白質(zhì)點的表達(dá)量上調(diào)超過10倍或下調(diào)超過90%，這5個蛋白質(zhì)點中有3個蛋白質(zhì)點表達(dá)量上調(diào)，2個蛋白質(zhì)點的表達(dá)量下調(diào)。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在大強度運動和力竭運動后大鼠心肌中出現(xiàn)多個缺失的蛋白質(zhì)點，這些點分布于心房肌和心室肌中[10, 11, 17]。但是在中等強度運動后缺失的蛋白質(zhì)點只發(fā)現(xiàn)于右心室肌，左心室肌和右心室肌未發(fā)現(xiàn)新增或缺失的蛋白質(zhì)點[8, 12, 15]。運動強度的差異可能是出現(xiàn)“缺失”蛋白質(zhì)點的原因，運動強度過大使大鼠心肌出現(xiàn)暫時性缺血缺氧或能量代謝障礙，進而引發(fā)大鼠心肌損傷，導(dǎo)致大強度運動后大鼠心肌蛋白質(zhì)缺失的發(fā)生。但在本研究中并未出現(xiàn)新增或缺失的蛋白質(zhì)點，可能和所采用的運動模型有關(guān)，中小強度的有氧運動單次對大鼠心臟的刺激不如力竭運動或者大強度運動，這一運動模式對心臟的影響可能需要長期反復(fù)不停的刺激，新增和缺失的點對心肌功能有何影響需結(jié)合蛋白質(zhì)的功能進行分析。

3.3 目標(biāo)蛋白質(zhì)的差異表達(dá)分析

通過對長期中小強度運動后4個表達(dá)量上調(diào)≥5倍或下調(diào)≥90%的蛋白質(zhì)點進行質(zhì)譜鑒定，共鑒定出3個蛋白質(zhì)和1個未知蛋白。

3.3.1 谷胱甘肽過氧化物酶1 2222號點經(jīng)質(zhì)譜鑒定為谷胱甘肽過氧化物酶1(glutathione peroxidase 1,GPX-1)。GPX-1是谷胱甘肽過氧化物酶 (glutathione peroxidase，GSH-Px)家族的一員，是機體重要的抗氧化酶。

本研究E組大鼠左心室肌GSH-1表達(dá)量發(fā)生顯著變化，上調(diào)了5.2倍，與彭勇等人[19]的研究結(jié)果相反，他們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過4周中等強度有氧運動后大鼠心房肌谷胱甘肽合成酶下調(diào)了6.1倍，推測可能是4周運動強度負(fù)荷和總量偏小，大鼠心房肌未發(fā)生強烈的應(yīng)激反應(yīng)。本研究中經(jīng)過8周中小強度的運動刺激，心肌抗氧化能力增強，提高了心肌在運動條件下對活性氧自由基的清除能力，防止運動過程中氧自由基對心肌的損傷，降低了心臟及血管發(fā)生病變的風(fēng)險，這和課題組前期[11]采用中等強度的有氧運動使右心室肌能量代謝水平提高、抗氧化能力增強的結(jié)果一致。因此可以推測，積累一定時間的中小強度有氧運動才能夠使心臟的的抗氧化系統(tǒng)得到加強，從而達(dá)到降低心臟及血管發(fā)生病變的風(fēng)險。

3.3.2 β-烯醇酶 經(jīng)質(zhì)譜鑒定的1914號點為β-烯醇酶(beta-enolase)，也稱為肌肉特異性烯醇酶(muscle-specific enolase, MSE)，一般情況MSE在血清中維持較低水平，當(dāng)肌肉出現(xiàn)損傷時，血清中MSE含量明顯上升[20]。在診斷肌損傷和急性心肌梗死時，常將血清MSE的升高作為有力證據(jù)，也有研究認(rèn)為可將MSE作為一種預(yù)測或診斷缺血性疾病的血液標(biāo)志物[21]。

本研究中E組大鼠左心室肌MSE的表達(dá)發(fā)生了顯著變化，上調(diào)了20.5倍。以往的研究認(rèn)為長期中等強度有氧運動能發(fā)揮心肌保護作用、增強心臟功能[17]。組織MSE表達(dá)水平的升高是否也提示大鼠心肌在長期中小強度有氧運動后出現(xiàn)了心肌損傷？若有損傷，其機制又是如何？心肌損傷的檢測常采用心肌損傷血液標(biāo)志物、心肌缺血缺氧染色等方法[22]。后續(xù)研究中可以采用這些方法結(jié)合對血清MSE含量進行檢測，對長時間中小強度運動后大鼠心肌損傷情況進行綜合評價。

3.3.3 cAMP依賴性蛋白激酶I型-α調(diào)節(jié)亞基 1895號點經(jīng)質(zhì)譜鑒定為cAMP依賴性蛋白激酶I型-α調(diào)節(jié)亞基(cAMP-dependent protein kinase type I-alpha regulatory subunit，PRKAR1α)，是一種蛋白激酶A( protein kinase A，PKA)調(diào)節(jié)亞基的亞單位。PRKAR1α和cAMP高度親和，是PKA最重要的調(diào)節(jié)亞基，在細(xì)胞生長和分化中起重要作用[23]。PRKARⅠα的表達(dá)水平和PRKARⅡα的表達(dá)水平呈明顯的負(fù)相關(guān)，腫瘤組織的惡性增生與PRKARⅠα的過表達(dá)有關(guān)[24]。

目前尚未發(fā)現(xiàn)有研究探討PRKAR1α與運動的關(guān)系，更多地是從醫(yī)學(xué)角度研究PRKAR1α的表達(dá)與癌細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)展。最近的研究表明，PRKAR1α的表達(dá)水平在多原發(fā)癌和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中明顯失調(diào)，PRKAR1α是一種抑癌基因和PKA活性調(diào)節(jié)基因[25]。本研究發(fā)現(xiàn)E組PRKARⅠα表達(dá)量下調(diào)了82.8%。長期中小強度運動抑制了PRKARⅠα的表達(dá)，是否意味通過長期中小強度運動能抑制細(xì)胞的惡性增殖與分化，具有一定的抑制癌細(xì)胞生長的功能，這一觀點若被驗證，或許將給癌癥早期患者的治療提供新的輔助手段。運動與癌癥之間研究主要集中運動干預(yù)對癌癥患者的康復(fù)、生活質(zhì)量影響方面，尚未發(fā)現(xiàn)運動抑癌相關(guān)機制方面的研究，應(yīng)結(jié)合多種方法進行綜合驗證并探討其機制。

3.3.4 未知蛋白 本研究2148號點Mr為138.478 Kda，pI為5.39，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為未知蛋白。該蛋白經(jīng)過長期中小強度有氧運動后表達(dá)量下調(diào)了 91.7%，發(fā)生了顯著變化。尚不清楚該蛋白屬于何種類型蛋白質(zhì)，在心肌中具有何種功能，但一定是對長期中小強度有氧運動敏感的一類蛋白質(zhì)。后期可以通過進一步實驗探討其結(jié)構(gòu)與功能，或許對補充長期中小強度運動對運動健身和心血管康復(fù)治療有著積極的意義。

綜上所述，長期中小強度有氧運動能使大鼠心臟出現(xiàn)良好的適應(yīng)性改變；大鼠左心室肌蛋白質(zhì)組發(fā)生了明顯變化。長期中小強度有氧運動能有效增強大鼠心肌抗氧化能力。采用長期中小強度的有氧運動進行鍛煉，能有效地提高身體機能狀態(tài)，增強心臟機能水平，達(dá)到很好的鍛煉健身的效果。中小強度的運動是否也會造成心肌損傷、是否具有一定的抑癌作用？有待進一步研究探討。