李 莉, 黃涵檉

(三峽大學第一臨床醫(yī)學院.宜昌市中心人民醫(yī)院， 湖北 宜昌 443003)

原發(fā)高血壓及2型糖尿病是危害人類健康的常見和多發(fā)病，其死亡的主要原因是冠心病、腦卒中、腎功能衰竭、酮癥酸中毒，并能損害眼、心、腦等多種器官，嚴重威脅著人類的健康甚至生命[1]。其慢性難治的特點，占用和消耗了大量的醫(yī)療資源，給個人、家庭和社會均帶來了沉重的心理壓力和嚴重的經濟負擔。研究證實，這兩種疾病與其前期同源性疾病(肥胖、高血脂、肝脂肪變性、動脈粥樣硬化)有密切關聯性[2]。雖然原發(fā)性高血壓和2型糖尿病的治愈難度大，但在有效降低并發(fā)疾病機率的前提下，積極治療其前期同源性疾病，是其有效的防治措施[3]。現代醫(yī)學已證實，中藥十字花科植物蘿卜(Raphanus sativus L)的成熟種子萊菔子(Radish Seed，RS)醇提物治療高血壓有效率達85.7%，RS或RS配伍治療高脂血癥具有持久療效[4]。其主要成分有多糖類、生物堿類、黃酮類、抗菌素類等。其中抗血酸、抗過敏、抗氧化多種作用的α-亞麻酸含量很高[5]。異硫氰酸鹽萊菔子素可阻止DNA損傷，抑制多種腫瘤細胞的生長與分化，是蔬菜中最強抗癌Ⅱ相酶誘導劑[5]。其黃酮類和多糖類成分，具有降血壓、降血脂、降血糖、抗血栓、抗氧化及增強免疫等作用[6]。有人用RS、黃連、水蛭干預高血壓胰島素抵抗模型大鼠肝細胞膜胰島素受體，減弱胰島素的抵抗效應[4]。我們利用8周齡ApoE-/-小鼠(雄性，18～20 g)在膽固醇的合成與代謝、受體和非受體轉運的途徑與比例方面與人類相似的特點，來制作肝脂質代謝紊亂模型，同時用萊菔子70%乙醇提物(alcohol extract of Radish Seed，AERS)干預，結果發(fā)現，AERS能有效降低血脂血糖作用，并能阻止脂肪肝變性，其機制與血漿TNF-α、載脂蛋白受體(HMG-R，LDL-R)和瘦素(leptin，LEP)受體蛋白表達相關。這對于防治原發(fā)性高血壓和2型糖尿病的前期同源性疾病(肥胖、高血脂、肝脂肪變性、動脈粥樣硬化)具有重要意義?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡ApoE-/-小鼠60只(SPF級)，雄性，18～20 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供(NO.11400700189994)。

1.2 藥品、試劑及器材

基礎飼料與墊料由湖北省實驗動物中心提供，其中高脂高糖高鹽飼料組成為：基礎飼料43%+豬油26%+高糖24%+膽固醇1.5%+膽酸0.5%+氯化鈉5%；羅格列酮(Rosiglitazone，RT，HPLC≥98%，CAS：122320-73-4，上海升德醫(yī)藥科技有限公司)；谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、游離脂肪酸(FFA)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、空腹胰島素(fasting insulin，FIns)和瘦素(LEP)等ELISA測定試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)；3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-R)、LDL-R、LEP-R抗體(圣克魯斯生物技術有限公司)。Trans-Blot cell電轉膜儀(美國BIO-RAD公司)；德國羅氏診斷公司血糖試紙(字2019第2400947號)；美國雅培利舒坦血糖儀；HBS-1096B酶標儀(南京德鐵實驗設備有限公司)；東軟威特曼生化儀(NT480)。

1.3 AERS的制備

購于湖北省中藥材研究所萊菔子(SemenRaphani，產地：湖北利川)5 kg，用10倍量70%乙醇提取3次，將3次提取液合并過濾濃縮成相當于10 g·1 ml-1生藥后，蒸干，研末，加上干燥劑密封冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 動物分組及造模

ApoE-/-小鼠適應性飼養(yǎng)1周后隨機分成6組，分別為對照組(control group，CG)、生理鹽水組(normal saline group，NG)、羅格列酮組(rosiglitazone group，RG)、AERS治療組，后者再分別分成AERS低、中、高劑量組(AERS-L/M/H)，每組10只，每籠5只，在標準實驗條件下每天自由進食和飲水。除CG給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)外，其他所有動物均以高脂高糖高鹽飼料飼養(yǎng)9周；同時，CG和NG分別每天以等容量NS灌胃1次，RG每天以羅格列酮灌胃1次(1.33 mg·kg-1)，AERS各組每天分別予AERS灌胃1次(100、300和900 mg·kg-1，均以NS稀釋成等容量溶液，每次0.2 ml·10 g-1)，共9周(最后3周，CG每天腹腔加注射等容量NS，其他各組每天腹腔加注地塞米松0.08 mg·100 g-1，加速誘導IR)。整個實驗均在標準實驗條件下(22±4℃，12 h光暗交替)完成。

1.5 一般情況觀察、飼料、體重、血糖及ELISA相關指標的測定

每周最后1 d禁食水12 h，觀察皮毛光澤度、整潔度及活動情況后，每天上午9:00-10:00按每克動物0.4 g/d給飼料，并稱取剩余飼料，計算1周內平均每天消耗量(feed consumption，FC)。計算方法如下：

在第9周最后1 d禁食水12 h，完成FW和稱空腹體重(fasting weight，FW)后，腹腔麻醉(10%水合氯醛0.5 ml·100 g-1)，心臟采血2 ml離心分離血清分裝凍存(-80℃)，用于檢測。用全自動生化儀或Elisa試劑盒測定血谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、游離脂肪酸(FFA)、瘦素(LEP)、TNF-α、低脂蛋白膽固醇(LDL-C)、空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)、空腹胰島素(fasting insulin，FIns)，檢測肝-甘油三酯(L-TG)和肝-總膽固醇(L-TC)，并計算胰島素抵抗指數(insulin resistance index，IRI)，計算方法如下[6]：

IRI=[FPG(mmol/L)×FIns(mU/L)]/22.5

1.6 肝系數及肝病理學觀測

取出肝臟，去除肝包膜及肝蒂，生理鹽水沖洗，濾紙吸干，在方位、同背景、同光強、同焦距和同視野下，以高倍相機拍攝肝臟外觀后，稱肝重(liver weight，LW)，計算肝臟系數(liver coefficient，LC)。切取肝右葉中上段，以10%甲醛固定，用于病理學觀察(石蠟包埋切片，HE染色，顯微鏡觀察)；剩余肝臟全部冷凍保存(-80℃)，用于相關檢測。LC計算方法如下[7，8]：

LC=LW/FW×100%

1.7 肝脂質代謝相關信號通路蛋白與mRNA表達的測定

Western blot檢測相關蛋白表達。按文獻[9]，取肝放入研缽，加液氮冷凍研細，取出樣本100 mg，加裂解液(RIPA 1 ml)超聲破碎3次(每次10 s)勻漿，冰上孵育15 min，13 000 r/min 4℃離心取上清，BCA法測定相關蛋白。加緩沖液變性和電泳轉膜后，加入相應試劑一抗，24 h后洗脫，加入相應二抗孵育洗脫曝光，分析相應蛋白表達水平(β-actin的相對值)。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 AERS對ApoE-/-小鼠一般情況、FC、FPG、Fins和IRI的影響

一般情況觀察結果發(fā)現，CG組動物的皮毛有光澤，整潔度與活動度良好；NG動物的皮毛分布較為雜亂，反應明顯遲緩，光澤度明顯差于CG；AERS各動物呈劑量依賴性優(yōu)于NG，其中AERS-H與CG相當，AERS-L與RG相當。

FC觀測結果顯示，隨時間的延長，FC呈現持續(xù)緩慢增加。5周以前，RG與AERS-L相當(P> 0.05)，顯著少于CG、AERS-M和AERS-H而高于NG(P<0.05)，AERS呈劑量依賴性增加，且AERS-M和AERS-H高于RG；最后3周，所有高脂飼料飼養(yǎng)動物的FC均呈快速增加，尤其AERS呈劑量依賴性快速增加，其中，NG與RG相當(P>0.05)并高于CG，而低于AERS-H/M(P<0.05，表1)。

FPG、Fins和IRI檢測結果顯示，隨時間的推移，NG逐漸增加，顯著高于其他各組(P<0.05)，表明高脂、高糖血癥及IR模型制造成功；AERS呈現劑量依賴性抑制FPG、Fins和IRI指標的升高，其中抑制FPG、Fins升高的作用弱于RG，AERS-H抑制IRI的作用強于RG(P<0.05，表2)。

Tab. 1 Effects of AERS on FC in ApoE-/- mice(g/d，

Tab. 2 Effects of AERS on FPG,Fins and IRI in ApoE-/-

2.2 AERS對ApoE-/-小鼠血清ALT、AST及TNF-α的影響

檢測結果發(fā)現，CG血清ALT、AST及TNF-α的指標顯著低于所有高脂飼料動物組。其中，NG與RG血清ALT和AST相當(P>0.05)，NG、RG和AERS-L血清TNF-α相當(P>0.05)，AERS呈劑量依賴性阻止血清ALT、AST和TNF-α升高，顯著低于NG和RG(P<0.05，表3)。

Tab. 3 Effects of AERS on ALT,AST and TNF-α in serum of

2.3 AERS對ApoE-/-小鼠相關血脂指標的影響

相關血脂指標檢測結果顯示，AERS呈劑量依賴性增加HDL-C，降低LDL-C及其他血脂指標。其中：NG顯著高于CG(P<0.05)，表明高脂血癥模型制造成功；AERS-H的HDL-C高于CG及其他各組(P<0.05)，其他血脂指標與CG相當(P>0.05)；NG的HDL-C顯著低于CG、AERS-M/H，而LDL-C顯著高于CG、AERS-M/H(P<0.05，表4)。結果還顯示，AERS 呈劑量依賴性抑制FFA和LEP的升高。其中，NG與RG相當(P>0.05)，顯著高于CG、AERS-M/H(P<0.05，表5)。

Tab. 4 Effects of AERS on lipids in ApoE-/- mice(mmol·L-1，

2.4 AERS對ApoE-/-小鼠血清LC、L-TG、L-TC的影響

結果表明，AERS 呈劑量依賴性降低LC、L-TG、L-TC。其中，AERS- H的LC、L-TG和L-TC與CG相當(P>0.05)，明顯低于NG和RG(P<0.05)，AERS呈劑量依賴性降低LC、L-TG和L-TC(P< 0.05，表6)；表明造模加速脂肪肝形成，AERS阻止脂肪肝形成。

Tab. 5 Effects of AERS on FFA and LEP in

2.5 AERS對ApoE-/-小鼠肝形態(tài)學的影響

肝臟外觀發(fā)現，AERS-M/H與CG肝臟外觀相似，邊緣銳利，無明顯腫大，包膜不緊張，表面光滑，呈現紅褐色，彈性良好，質軟，切面未見明顯油膩感；NG和RG肝臟外觀相似，相對AERS-M/H與CG來說，邊緣圓鈍，明顯腫大，包膜緊張，表明粗糙，呈土黃色，彈性差，質硬，切面可見明顯油膩感(圖1A)。

肝臟病理學發(fā)現，AERS-M/H和CG相似，肝小葉結構正常，肝索排列整齊，肝細胞大小均一，形態(tài)正常，無肝細胞壞死，無脂肪空跑；NG和RG相似，相對AERS-M/H和CG來說，肝小葉大多變形，肝索排列明顯紊亂，肝細胞大小不均勻，多數變形，在中央靜脈周圍可見肝細胞氣球樣脂肪空泡，顯示明顯的混合型肝細胞脂肪變性，部分出現炎性細胞浸潤，存在肝細胞壞死(圖1B)。

Tab. 6 Effects of AERS on LC、L-TG and L-TC of serum in ApoE-/-

Fig. 1A Effects of AERS on outline and cutaway of liver in ApoE-/- mice

Fig. 1B Effects of AERS on liver pathology in ApoE-/- mice(HE ×100)

2.6 AERS對ApoE-/-小鼠肝HMG-R、LDL-R和LEP-R蛋白表達的影響

結果顯示，NG與RG的三種蛋白表達均相當(P>0.05)，其中，HMG-R、LDL-R和LEP-R蛋白表達明顯高于其他各組(P<0.05)；AERS呈劑量依賴性減少HMG-R蛋白表達，顯著低于NG和RG(P<0.05，圖2)。

Fig. 2 Effects of AERS on protein expression of HMG-R、LDL-R and LEP-R in ApoE-/- n=10)

3 討論

由于原發(fā)性高血壓和2型糖尿病的病因不明，僅僅發(fā)現其與前期同源性疾病(肥胖、高血脂、肝脂肪變性、動脈粥樣硬化)密切相關聯[10]，是IR病理基礎和重要危險因素[11]。而這些同源性疾病的發(fā)生發(fā)展又與肝內脂質代謝及其相關蛋白表達密切相關[12,13]。因此，積極治療前期同源性疾病，尤其是肝內脂質代謝異常是原發(fā)性高血壓和2型糖尿病的重要防治措施[14]。我們研究證實，萊菔子主要成分芥子堿硫氰酸，對TNF-α所導致的血管內皮細胞變化具有良好的調控作用，對肝細胞正常脂質代謝具有良好的維持效應，其機制與脂肪細胞SREBP-2、p-p38、p-ERK及p-JNK等信號通路相關蛋白和mRNA表達的調控有關[15]。為深入研究萊菔子的相關作用與機制，本研究利用具脂質代謝紊亂和IR遺傳背景的ApoE-/-基因剔除小鼠誘導脂質代謝紊亂和IR模型[15]，以萊菔子醇提物干預。結果表明，萊菔子醇提物能有效阻止高血脂、高血糖、肝脂肪變性及IR的發(fā)生發(fā)展。其作用機制可能與下列因素有關。

與抑制TNF-α表達有關。本研究證實，萊菔子醇提物呈劑量依賴性降低TNF-α及ALT、AST、IRI，顯著低于所有高脂飼料動物組，與對照組相當。表明萊菔子醇提物能有效減輕肝脂肪變性所導致的低度炎性損傷，保護肝細胞，維持肝細胞的正常代謝。因為，肝是脂質代謝的主要場所，肥胖能誘發(fā)的器官慢性炎性反應，是減弱對胰島素的敏感性而形成IR的重要機制[16]。肝脂肪細胞能產生的TNF-α，繼而有效活化胰島素的靶細胞炎性通路(JNK、IκKβ等)，進一步激活下游NF- κB而正反饋加促進炎癥細胞因子TNF-α、TGF-β、IL6、IL-1β、IL-8、IL-10等的快速表達，反過來進一步加重肝臟炎性反應和肝細胞損傷[16]。

與抑制HMG-R和促進LDL-R蛋白表達有關。本研究證實，萊菔子醇提物呈劑量依賴性增加血和肝臟的HDL-C，降低TG、TC及LDL-C，且抑制HMG-R蛋白表達，增加LDL-R蛋白表達，其高劑量的作用明顯強于羅格列酮。表明其降低血脂、血糖，阻止肝細胞脂肪變性的機制與羅格列酮不同，可能與抑制HMG-R和促進LDL-R的蛋白表達有關。因為，肝細胞合成Ch的關鍵限速酶是HMG。因此，抑制HMG-R，可增加游離HMG的量，限制Ch的合成，促進Ch的攝取，最終降低血Ch[14]。此外，還可抑制VLDL的生成，降低血管壁通透性，上調肝細胞膜LDL-R，增加HDL-C的合成，加速Ch的轉運，同時，促進β-VLDL和VLDL殘粒(正常情況下VLDL殘粒很難轉化成VLDL)的異化，最終降低血LDL-C，阻止血管內膜脂質沉積和血管內膜的增厚[14]。

與減少FFA和LEP的生成，抑制LEP-R蛋白表達有關。本研究證實，萊菔子醇提物呈劑量依賴性抑制血FFA和LEP的升高和LEP-R蛋白表達，表明其降低血脂、血糖，阻止肝細胞脂肪變性的機制與羅格列酮另一不同點在于，可能與減少FFA和LEP的生成，抑制LEP-R蛋白表達密切相關。因為，脂肪細胞因子(LEP、FFA等)由脂肪細胞直接分泌，并參與IR[16]。肥胖基因編碼的LEP，與LEP-R結合，調控多種代謝通路及生理功能[17,18]。高TG能阻止LEP的轉運，促進機體對LEP產生抵抗[19]。FFA可促進肝糖的異生和胰島素的分泌，并抑制肝代謝胰島素的能力，而促使高胰島素血癥和IR[20]。LEP可干擾胰島素在脂肪細胞的脂肪合成、糖轉運和信號轉導等加速IR的形成[18]。有研究報道，較高血脂和高血糖血癥而言，高LEP和高FFA血癥既是更早和更靈敏預測機體糖脂代謝紊亂的標志物，也是早期預測IR的重要標志物[18]。

本研究證實了，萊菔子醇提物能阻止高脂飼料誘導ApoE-/-小鼠血脂血糖升高及肝脂肪變性，其機制與減少FFA和LEP的生成，抑制TNF-α、HMG-R、LEP-R蛋白表達和促進LDL-R的蛋白表達有關?？赡苁瞧涠喑煞值亩喟悬c共同效應所致，這只能是其降脂、降糖和阻止肝脂肪變性的作用機制之一，其詳細機制及作用成分有待進一步探討。