劉 莉， 徐 凱， 王祿強(qiáng)， 徐美麗

(1. 濰坊市第二人民醫(yī)院血液科， 山東 濰坊 261041； 2. 陽光融和醫(yī)院心血管介入科， 山東 濰坊 261000； 3. 陽光融和醫(yī)院心血管介入科， 山東 濰坊 261000； 4. 濰坊市第二人民醫(yī)院血液科， 山東 濰坊 261041)

NK/T細(xì)胞淋巴瘤(NK/T cell lymphoma)作為一種非霍奇金淋巴瘤，占我國淋巴瘤的11-14%，其惡性程度高，患者預(yù)后不良，5年總體生存率低至32%，中位生存時間8個月[1]。因此，研究影響其惡性表型的分子機(jī)制，對于臨床評估及治療方案的指定具有重大意義。微小RNA (MicroRNA, miRNA)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控編碼基因的信使RNA(messenger RNA, mRNA)的降解及翻譯過程，是重要的表觀遺傳調(diào)控分子，miR-155-3p作為miRNA中的一員，其基因定位于染色體21q21.3上，近年其被報道參與乳腺癌、肝細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2，3]，但其與NK/T細(xì)胞淋巴瘤的關(guān)系仍不明確。本研究通過生物信息技術(shù)發(fā)現(xiàn)血液腫瘤中抑癌蛋白RNA聚合酶II的延伸相關(guān)因子(elongation factor for RNA polymerase II associated factor 1，EAF1)[4，5]可作為miR-155-3p的靶基因，這提示miR-155-3p可能參與影響NK/T細(xì)胞淋巴瘤惡性表型?；谏鲜鼍€索，本研究對相關(guān)問題開展了如下工作。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人NK/T細(xì)胞淋巴瘤HANK1細(xì)胞(上海雅吉生物)；IMDM培養(yǎng)基及胎牛血清FBS(美國Gibco)；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(美國Thermo Fisher Scientific)；pENTER-puro空白載體及pENTER-miR-155-3p過表達(dá)載體(湖南豐暉生物)；GV248對照載體及GV248-miR-155-3p siRNA干擾載體(上海吉凱基因)；放線菌素D(Actinomycin D，ActD，美國MedChemExpress)；TRIzol試劑(美國Invitrogen)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及sybr green核酸染料(日本Takara)；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒(上海碧云天生物)；聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜，美國Merck Millipore)；小鼠單克隆anti-EAF1抗體(美國Santa Cruz Biotechnology，sc-373832)、兔單克隆anti-β-catenin抗體(美國Cell Signaling Technology，#9562)、兔單克隆anti-c-Myc抗體(美國Cell Signaling Technology，#18583)，小鼠單克隆anti-β-actin抗體(美國Santa Cruz Biotechnology，sc-47778)，Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒(上海東仁化學(xué))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

使用80%IMDM+20%FBS培養(yǎng)HANK1細(xì)胞，每48 h進(jìn)行一次細(xì)胞傳代，傳代方法：將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液后加入新鮮80%IMDM+20%FBS，混合均勻后轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2及飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及處理

培養(yǎng)對數(shù)生長期的HANK1細(xì)胞，傳代擴(kuò)大培養(yǎng)并分為空白組、過表達(dá)組及對照組、干擾組，將細(xì)胞懸液移至離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄去剩余培養(yǎng)液，PBS洗細(xì)胞3次，同時每組制備3 ml無血清RPMI-1640+10 μl Lipofectamine 2000+ 2 μg目的載體，其中空白組中目的載體為pENTER-puro空白載體，過表達(dá)組中目的載體為pENTER-miR-155-3p過表達(dá)載體，對照組中目的載體為GV248對照載體，干擾組中目的載體為GV248-miR-155-3p siRNA干擾載體，放入培養(yǎng)箱中孵育6 h后，將細(xì)胞懸液移至離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，PBS洗細(xì)胞3次，加入90%RPMI-1640+10%FBS培養(yǎng)24 h，完成細(xì)胞轉(zhuǎn)染。為了觀察各組細(xì)胞EAF1 mRNA降解速率，采用5 μg/ml ActD處理各組細(xì)胞1、2、4、8及16 h，檢測EAF1 mRNA降解情況，并通過Graphpad8.0軟件計算EAF1 mRNA的半衰期(%)。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)(RT-qPCR)

TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA，取1 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，1 ml無核酶水稀釋逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，配制合成引物(上海生工)，引物序列：miR-155-3p F：5'-GCAGCTAGCCCAGGGTTGGAACTGAGTTTGA-3'、R：5'- GCAAAGCTTCAGTTAACCCG-3'；EAF1 F：5'-GACTACCCAGCCAGTGAAGT-3'、R：5'-ACTAAGCGCCTCTGACACTT-3'；β-catenin F：5'- AATCCGAGGACTCAATACC -3'、R：5'- AGAGTAAAGTATTCACCCACA -3'；c-Myc F：5'-TGGTCTTCCCCTACCCTCTCAAC-3'、R：5'-GATCCAGACTCTGACCTTTTGCC-3'；β-Actin F：5'-GCATGGAGTCCTGTGGCAT-3'、R：5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGG-3'。10 μl sybr green核酸染料+5 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物+5 μl合成引物，在7500型實(shí)時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems)中進(jìn)行qPCR反應(yīng)，得到各組樣本達(dá)到熒光信號閾值的循環(huán)數(shù)(cycle threshold，CT)，以β-actin為內(nèi)參基因，2(-△△CT)法計算miR-155-3p、EAF1、β-catenin及c-Myc的表達(dá)，每組樣本保證5個獨(dú)立的重復(fù)孔。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)

RIPA裂解液于冰上裂解各組細(xì)胞20 min以抽提總蛋白，各組細(xì)胞取50 μg與Loading buffer煮沸5 min，進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜后，10%脫脂牛奶室溫封閉2 h，PBS洗膜3次，1∶ 1 000一抗及1∶3 000內(nèi)參蛋白β-actin一抗4℃孵膜過夜，PBS洗膜3次，1∶2 000二抗室溫孵膜2 h，PBS洗膜3次，ECL發(fā)光液孵膜1 min，在暗室中ChemiDoc化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國BioRad)對膜曝光顯影，灰度掃描重復(fù)取3次結(jié)果。

1.6 CKK-8實(shí)驗(yàn)

將各組細(xì)胞以每孔2000個細(xì)胞密度接種至96孔板中，設(shè)置時間點(diǎn)0、24、48、72 h，90%RPMI-1640+10%FBS培養(yǎng)過夜后，檢測0 h細(xì)胞增殖活力，每孔加入10 μl CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，多孔酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad)檢測450 nm處吸光度(optical density，OD)值。同樣在24、48、72 h重復(fù)上述檢測，將各時間點(diǎn)與0 h相對OD值的比值(OD各時間點(diǎn)/OD0h)表示細(xì)胞的相對增殖能力，每組樣本保證5個獨(dú)立的重復(fù)孔。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞miR-155-3p、EAF1、β-catenin及c-Myc mRNA水平的比較

空白組、過表達(dá)組、對照組及干擾組miR-155-3p表達(dá)分別為1.00±0.06、8.52±0.47、1.00±0.08及0.22±0.01； EAF1 mRNA表達(dá)分別為1.00±0.07、0.30±0.02、1.00±0.08及3.51±0.35；β-catenin mRNA表達(dá)分別為1.00±0.07、3.38±0.26、1.00± 0.08及0.50±0.04；c-Myc mRNA表達(dá)分別為1.00± 0.05、2.62±0.29、1.00±0.03、0.38±0.02。相比空白組，過表達(dá)組細(xì)胞miR-155-3p、β-catenin及c-Myc mRNA表達(dá)水平顯著增高，EAF1表達(dá)則顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1A)；相比對照組，干擾組細(xì)胞miR-155-3p、β-catenin及c-Myc mRNA表達(dá)水平顯著降低，EAF1表達(dá)則顯著增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1B)。表明miR-155-3p可抑制HANK1細(xì)胞EAF1 mRNA的表達(dá)，并促進(jìn)β-catenin及c-Myc mRNA的表達(dá)水平。

2.2 各組細(xì)胞EAF1、β-catenin及c-Myc蛋白水平的比較

空白組、過表達(dá)組、對照組及干擾組EAF1 蛋白表達(dá)分別為1.00±0.09、0.52±0.07、1.00±0.12及5.85±0.71；β-catenin 蛋白表達(dá)分別為1.00±0.10、6.20±0.43、1.00±0.15及0.38±0.06；c-Myc蛋白表達(dá)分別為1.00±0.07、4.43±0.36、1.00±0.08、0.35±0.06。相比空白組，過表達(dá)組細(xì)胞β-catenin及c-Myc蛋白表達(dá)顯著增高，EAF1蛋白表達(dá)則顯著降低(P<0.05，圖2A)；相比對照組，干擾組細(xì)胞β-catenin及c-Myc蛋白表達(dá)顯著降低，EAF1蛋白表達(dá)則顯著增高(P<0.05，圖2B)。 表明miR-155-3p同樣可抑制HANK1細(xì)胞EAF1蛋白表達(dá)，并促進(jìn)β-catenin及c-Myc 蛋白表達(dá)水平。

Fig. 1 Expressions and comparisons of miR-155-3p, EAF1, β-Catenin and c-Myc mRNA in each group n=5)

Fig. 2 Protein blotting of EAF1, β-Catenin and c-Myc in each group n=3)

2.3 各組細(xì)胞EAF1 mRNA降解速率的比較

空白組、過表達(dá)組、對照組及干擾組EAF1 mRNA半衰期分別為(9.81±0.72)、(13.07±1.12)、(13.28±0.71)及(15.74±0.98)h。相比空白組，過表達(dá)組細(xì)胞EAF mRNA降解速率顯著加快，半衰期明顯縮短，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3A)；相比對照組，干擾組細(xì)胞EAF mRNA降解速率顯著減緩，半衰期明顯延長，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05，圖3B)。而各組細(xì)胞β-Actin降解速率沒有差異(P>0.05，圖3C及3D)。表明miR-155-3p可加速EAF1 mRNA的降解。

2.4 各組細(xì)胞惡性增殖能力的比較

以0 h時間點(diǎn)為相對值1，空白組、過表達(dá)組、對照組及干擾組48 h相對增殖能力分別為(3.95±0.44)、(5.38±0.55)、(3.67±0.26)及(2.71± 0.28)，72 h相對增殖能力分別為(8.21±0.56)、 (12.03±0.40)、(7.74±0.54)及(5.60±0.61)。相比空白組，過表達(dá)組細(xì)胞增殖能力在48、72 h時顯著增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖4A)；相比對照組，干擾組細(xì)胞增殖能力在48、72 h時顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖4B)。提示miR-155-3p可促進(jìn)HANK1細(xì)胞的增殖能力。

Fig. 3 EAF1 mRNA degradation in each group n=5)

Fig. 4 Comparison of malignant proliferation ability of cells in each group n=5)

3 討論

miRNA可通過切斷靶基因mRNA分子或抑制靶基因mRNA的翻譯過程影響靶基因的表達(dá)水平[6]。miR-155-3p作為miRNA的成員，被發(fā)現(xiàn)可與多種靶基因結(jié)合，進(jìn)而在不同生命過程中發(fā)揮作用，包括影響惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7，8]。Tang B[2]等研究指出，miR-155-3p在肝癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)，過表達(dá)miR-155-3p可促進(jìn)肝癌細(xì)胞體內(nèi)外增殖能力，該效應(yīng)與抑制FBXW7(F-box and WD repeat domain-containing 7)mRNA 的表達(dá)有關(guān)；Zhang G[3]等發(fā)現(xiàn)miR-155-3p在乳腺癌組織及細(xì)胞中表達(dá)顯著升高，同時miR-155-3p可通過下調(diào)細(xì)胞粘附分子1(cell adhesion molecule 1，CADM1)mRNA 水平，促進(jìn)細(xì)胞惡性增殖并抑制細(xì)胞凋亡；Tao M[8]等在腎透明細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)MIR155HG/miR-155-5p/3p的高表達(dá)，干擾miR-155-3p可顯著降低細(xì)胞增殖、侵襲及遷移等惡性表型；Fonte E等[9]在氟達(dá)拉濱耐藥的慢性淋巴細(xì)胞白血病中發(fā)現(xiàn)miR-155-3p的顯著高表達(dá)，這提示miR-155-3p可能參與影響血液腫瘤細(xì)胞的惡性行為。上述證據(jù)均提示miR-155-3p可能是血液腫瘤的潛在促癌基因，故本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測分析尋找可能的線索，發(fā)現(xiàn)EAF1可作為miR-155-3p的靶基因。

11-19賴氨酸富集白血病(eleven-nineteen lysine-rich leukemia，ELL)是混合系白血病(mixed lineage leukemia，MLL)基因的融合蛋白，其與MLL基因倒位可誘發(fā)人類急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)，而EAF1作為ELL蛋白的相互作用分子，其可與ELL蛋白的N端1-117AA及C端401-621AA相互結(jié)合[10，11]，兩者在細(xì)胞核中形成Cajal bodies，進(jìn)而參與RNA轉(zhuǎn)錄及加工復(fù)合體[12]。Shilatifard A及Luo RT等[13，14]研究顯示ELL-MLL融合蛋白中ELL與EAF1結(jié)合的N端結(jié)構(gòu)域缺失，而C端在融合蛋白中保留，人工合成的MLL-EAF1能誘導(dǎo)小鼠白血病的發(fā)生，進(jìn)一步研究表明，MLL-ELL及MLL-EAF1的白血病細(xì)胞中，野生型EAF1表達(dá)量顯著降低[12]，這些證據(jù)表明EAF1的功能與白血病的發(fā)生密切相關(guān)。Liu JX[5]等利用斑馬魚模型發(fā)現(xiàn)EAF1可抑制Wnt/β-catenin信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，而Wnt/β-catenin作為經(jīng)典的原癌信號通路，是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵調(diào)控因素[15，16]，該證據(jù)暗示EAF1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中存在潛在調(diào)控作用。

本研究結(jié)果顯示，在人NK/T細(xì)胞淋巴瘤HANK1細(xì)胞模型中，過表達(dá)miR-155-3p可顯著抑制EAF1 mRNA及蛋白水平的表達(dá)，同時促進(jìn)EAF1靶基因β-catenin及c-Myc的轉(zhuǎn)錄活性，而干擾miR-155-3p則可促進(jìn)EAF1表達(dá)，并抑制下游原癌基因β-catenin及c-Myc的轉(zhuǎn)錄。結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測分析的結(jié)果以及miRNA經(jīng)典的調(diào)控模式[6-8]，推測miR-155-3p可能通過影響靶基因EAF1 mRNA的表達(dá)在HANK1細(xì)胞中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。因此本研究首先明確miR-155-3p對EAF1的調(diào)控模式，通過ActD處理來觀察miR-155-3p對EAF1 mRNA降解速率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-155-3p可促進(jìn)EAF1 mRNA的降解速率，反之抑制其降解，表明miR-155-3p可通過促進(jìn)EAF1 mRNA的降解，影響EAF1的表達(dá)水平，進(jìn)而導(dǎo)致下游基因β-catenin及c-Myc表達(dá)的變化，這與miR-155-3p已知的調(diào)控方式類似[2，3]，但本研究在HANK1細(xì)胞中找到miR-155-3p新的靶基因EAF1，這為腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了新的方向。進(jìn)一步的生物學(xué)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-155-3p可增強(qiáng)HANK1細(xì)胞的惡性增殖能力，且干擾miR-155-3p則抑制細(xì)胞增殖能力。結(jié)合miR-155-3p加速EAF1 mRNA的降解及EAF1在不同腫瘤中發(fā)揮顯著的抑癌效應(yīng)[12, 15-17]，本研究表明：miR-155-3p可介導(dǎo)HANK1細(xì)胞EAF1 mRNA的降解，并促進(jìn)細(xì)胞惡性增殖能力。