陳 剛， 陳九霖， 吳 俊

(黔西南州人民醫(yī)院心血管內(nèi)科， 貴州 黔西南州 562400)

動(dòng)脈粥樣硬化是由多因素、多細(xì)胞參與的進(jìn)行性血管性疾病，是心血管疾病的主要病理基礎(chǔ)[1]。低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)水平的升高及其氧化修飾是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)因素。氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，oxLDL)可增加活性氧的產(chǎn)生，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和過(guò)度凋亡，破壞血管組織[2]。因此如何有效的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷和凋亡是遏制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的關(guān)鍵。微小RNA(microRNA，miRNAs)是一類(lèi)短鏈內(nèi)源性非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)miR-133b在1甲基4苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+)誘導(dǎo)的帕金森病多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞模型中下調(diào)表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-133b具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用[3]。miR-133b的表達(dá)下調(diào)還與甲基苯丙胺誘導(dǎo)的神經(jīng)元毒性損傷有關(guān)[4]。此外，抑制大鼠心肌細(xì)胞miR-133b表達(dá)可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷和凋亡[5]。但miR-133b對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響尚未可知。生物信息學(xué)分析顯示富含谷氨酰胺三十四肽重復(fù)序列小蛋白質(zhì)分子(small glutamine-rich tetratricopeptide repeat containing，SGTB)是miR-133b的候選靶基因。研究顯示SGTB參與骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展，高表達(dá)SGTB可促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡[6]。但miR-133b能否靶向SGTB參與對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的調(diào)控尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究旨在揭示miR-133b和SGTB在oxLDL誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用，以期為防治動(dòng)脈粥樣硬化血管損傷提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株EVC-304購(gòu)于美國(guó)ATCC；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；oxLDL購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；LipofectamineTM2000和TRIzol試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；模擬物陰性對(duì)照(miR-NC)、miR-133b模擬物(miR-133b mimics)、小干擾RNA陰性對(duì)照(si-NC)、SGTB小干擾RNA(si-SGTB)、空載體(pcDNA)、過(guò)表達(dá)SGTB載體(pcDNA-SGTB)、野生型熒光素酶報(bào)告基因載體(WT-SGTB)、突變型熒光素酶報(bào)告基因載體(MUT-SGTB)由廣州銳博生物公司提供；膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海貝博生物生物技術(shù)有限公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量檢測(cè)試劑盒、超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathion peroxidase，GSH-Px)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；兔源SGTB抗體、兔源B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukaemia -2，Bcl-2)抗體、兔源Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗體、兔源磷酸甘油醛脫氫酶(phosphoglyceraldehyde dehydrogenase，GAPDH)抗體、以及山羊抗兔Ⅱ抗購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組

將EVC-304細(xì)胞按照1×106cells/L接種到24孔板，隨機(jī)分為以下幾組。對(duì)照(control，Con)組為正常培養(yǎng)的EVC-304細(xì)胞；oxLDL組采用oxLDL濃度為100 μg/ml的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)EVC-304細(xì)胞24 h。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將EVC-304按照2×105cells/well接種6孔板，細(xì)胞匯合度達(dá)到60%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用50 μl的opti-MEM培養(yǎng)液稀釋待轉(zhuǎn)染物(轉(zhuǎn)染細(xì)胞的終濃度為20 nmol/L)，室溫作用5 min，記為混合物A。用50 μl的opti-MEM培養(yǎng)液稀釋1.0 μl的LipofectamineTM2000，室溫作用5 min，記為混合物B。將混合物A和混合物B混合，室溫作用20 min，記為混合物C。將含混合物C加入60%匯合的EVC-304細(xì)胞，6 h后更換為含血清MEM培養(yǎng)基，收集轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞。oxLDL+miR-NC組、oxLDL+miR-133b組、oxLDL+si-NC組、oxLDL+si-SGTB組、oxLDL+miR-133b+pcDNA組、oxLDL+miR-133b +pcDNA-SGTB組為分別用含100 μg/ml oxLDL的細(xì)胞培養(yǎng)液處理轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染miR-NC、轉(zhuǎn)染miR-133b mimics、轉(zhuǎn)染si-NC、轉(zhuǎn)染si-SGTB、轉(zhuǎn)染miR-133b與pcDNA、轉(zhuǎn)染miR-133b與pcDNA-SGTB的EVC-304細(xì)胞24 h。僅轉(zhuǎn)染miR-NC、轉(zhuǎn)染miR-133b mimics、轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、轉(zhuǎn)染anti-miR-133b的EVC-304細(xì)胞記為miR-NC組、miR-133b組、anti-miR-NC組、anti-miR-133b組。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 普通倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征

EVC-304細(xì)胞按照1.2分組進(jìn)行培養(yǎng)，刺激結(jié)束后用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，并拍照。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)miR-133b和SGTB mRNA的表達(dá)

采用TRIzol試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。引物由上海生工公司合成，序列如下：miR-133b上游序列：5’-AAACCTGGCGGCCACGCTAC-3’，下游序列：5’-GACCGTGGTCCACTGCAGGC-3’；U6上游序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；SGTB上游引物序列：5’-CCGCTCAAAGCAAACTAA-3’，下游引物序列5’-TGTAACTGCCTCTTCAAAC-3’；GAPDH上游引物序列5’-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3’，下游引物序列5’-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-3’。依照2-ΔΔCt法計(jì)算miR-133b和SGTB mRNA的表達(dá)水平。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

收集按照上述分組進(jìn)行干預(yù)的各組細(xì)胞，采用結(jié)合緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106cells/ml。取100 μl的細(xì)胞懸液，依次加入5 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI，混勻后避光孵育15 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.6 Western blot檢測(cè)SGTB、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)

收集按照上述分組進(jìn)行干預(yù)的各組細(xì)胞，加入4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min，用BCA法測(cè)定每組細(xì)胞蛋白濃度。配制分離膠和濃縮膠，每孔上樣30 μg細(xì)胞蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。結(jié)束后，利用常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜裝置將細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。將膜置于5%的脫脂牛奶中封閉1 h，TBST洗膜后，將膜置于稀釋的Ⅰ抗中4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后，加入稀釋的Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后，采用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，以GAPDH為內(nèi)參，用圖像分析軟件ImageJ分析各目的條帶的灰度值。

1.7 試劑盒檢測(cè)MDA含量、SOD和GSH-Px活性

收集按照上述分組進(jìn)行干預(yù)的各組細(xì)胞，離心后棄去上清，按照試劑盒操作步驟，破碎細(xì)胞并收集上清液，酶標(biāo)儀檢測(cè)各組樣本的吸光度值，計(jì)算MDA含量、SOD和GSH-Px活性。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-133b和SGTB的靶向關(guān)系

采用TargetScan預(yù)測(cè)miR-133b的靶基因顯示，miR-133b與SGTB的3’-UTR區(qū)域存在部分連續(xù)互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)SGTB可能是miR-133b的靶基因并進(jìn)行驗(yàn)證。將WT-SGTB和MUT-SGTB分別與miR-133b、miR-NC共轉(zhuǎn)染至EVC-304細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h，雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒測(cè)定各組細(xì)胞熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 miR-133b和SGTB在oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的表達(dá)

oxLDL誘導(dǎo)后血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-133b的表達(dá)顯著降低，SGTB mRNA和SGTB蛋白的表達(dá)量顯著升高(P<0.05，表1，圖1)。正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞單層生長(zhǎng)，呈鋪路石樣先前排列，邊界清楚，分布均勻；經(jīng)oxLDL刺激后細(xì)胞數(shù)目減少，圓形細(xì)胞增多，細(xì)胞收縮，胞膜皺縮，邊界不清楚，部分脫落(圖2)。

Fig. 1 SGTB protein expression

Fig. 2 Effects of oxLDL on the morphology of vascular endothelial cells

Tab. 1 Expressions of miR-133b and SGTB in oxLDL induced vascular endothelial cell n=9)

2.2 miR-133b過(guò)表達(dá)對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

與Con組比較，oxLDL組血管內(nèi)皮細(xì)胞胞體縮小、皺縮，核膜模糊，較多的細(xì)胞變圓脫落，miR-133b的表達(dá)顯著降低，Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著降低，Bax蛋白的表達(dá)顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高；與oxLDL+miR-NC組比較，oxLDL+miR-133b組血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)明顯改善，皺縮和懸浮細(xì)胞明顯減少，miR-133b的表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著升高，Bax蛋白的表達(dá)顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05，表2，圖3，圖4)。

Fig. 3 Effect sof miR-133b overexpression on apoptosis of vascular endothelial cells induced by oxLDL

Fig. 4 Effects of miR-133b overexpression on the morphology of vascular endothelial cells induced by oxLDL

Tab. 2 Effects of miR-133b overexpression on apoptosis of vascular endothelial cells induced by n=9)

2.3 miR-133b過(guò)表達(dá)對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

與Con組比較，oxLDL組血管內(nèi)皮細(xì)胞MDA的含量顯著升高，SOD和GSH-Px的活性顯著降低；與oxLDL+miR-NC組比較，oxLDL+miR-133b組血管內(nèi)皮細(xì)胞MDA的含量顯著降低，SOD和GSH-Px的活性顯著升高(P<0.05，表3)。

Tab. 3 Effect of miR-133b overexpression on oxidative stress induced by oxLDL in vascular endothelial n=9)

2.4 干擾SGTB表達(dá)對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響

與Con組比較，oxLDL組血管內(nèi)皮細(xì)胞胞體縮小、皺縮，核膜模糊，較多的細(xì)胞變圓脫落，SGTB和Bax蛋白的表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著降低，MDA含量顯著升高，SOD和GSH-Px活性顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著增加；與oxLDL+si-NC組比較，oxLDL+si-SGTB組血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)明顯改善，皺縮和懸浮細(xì)胞明顯減少，SGTB和Bax蛋白的表達(dá)顯著降低，Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著升高，MDA含量顯著降低，SOD和GSH-Px活性顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05，圖5，圖6，表4)。

Fig. 5 Effects of interfering SGTB expression on OxLDL-induced vascular endothelial cell injury

Fig. 6 Effects of interfering SGTB expression on the morphology of vascular endothelial cells

Tab. 4 Effects of interfering SGTB expression on OxLDL-induced vascular endothelial cell n=9)

2.5 miR-133b靶向調(diào)控SGTB的表達(dá)

通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站TargetScan預(yù)測(cè)miR-133b的靶基因，結(jié)果顯示miR-133b與SGTB的3’-UTR區(qū)域存在連續(xù)互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖7A。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示見(jiàn)表5，與miR-NC和WT-SGTB共轉(zhuǎn)染組比較，miR-133b mimics和WT-SGTB共轉(zhuǎn)染組血管內(nèi)皮細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P< 0.05)；與miR-NC和MUT-SGTB共轉(zhuǎn)染組比較，miR-133b mimics和MUT-SGTB共轉(zhuǎn)染組血管內(nèi)皮細(xì)胞的熒光素酶活性無(wú)顯著變化。Western blot檢測(cè)顯示，與miR-NC組(0.49±0.04)比較，miR-133b組血管內(nèi)皮細(xì)胞SGTB蛋白的表達(dá)水平(0.22± 0.03)顯著降低；與anti-miR-NC組(0.47±0.04)比較，anti-miR-133b組血管內(nèi)皮細(xì)胞SGTB的表達(dá)水平(0.95±0.08)顯著升高(P<0.05，圖7B)。以上結(jié)果說(shuō)明在血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-133b靶向負(fù)性調(diào)控SGTB表達(dá)。

Fig. 7 miR-133b targeted and negatively regulated SGTB expression

Tab. 5 Double Luciferase report n=9)

2.6 SGTB過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-133b過(guò)表達(dá)對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用

與oxLDL+miR-NC組比較，oxLDL+miR-133b組血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)明顯改善，皺縮和懸浮細(xì)胞明顯減少，SGTB和Bax蛋白的表達(dá)顯著降低，Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著升高，MDA含量顯著降低，SOD和GSH-Px活性顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低；與oxLDL+miR-133b+pcDNA組比較，oxLDL+miR-133b+ pcDNA-SGTB組血管內(nèi)皮細(xì)胞胞體縮小、皺縮，核膜模糊，較多的細(xì)胞變圓脫落，SGTB和Bax蛋白的表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著降低，MDA含量顯著升高，SOD和GSH-Px活性顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05，圖8，圖9，表6)。

3 討論

OxLDL介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷是早期動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的關(guān)鍵。因此，本研究建立以O(shè)xLDL誘導(dǎo)的體外內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，探討與內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷和凋亡有關(guān)的基因，為防治動(dòng)脈粥樣硬化血管損傷提供理論基礎(chǔ)。

Fig. 8 SGTB overexpression reversed the effects of miR-133b overexpression on oxLDL-induced vascular endothelial cell damage

Fig. 9 SGTB overexpression reversed the effects of miR-133b overexpression on the morphology of vascular endothelial cells

Tab. 6 SGTB overexpression reversed the effects of miR-133b overexpression on oxLDL-induced vascular endothelial cell n=9)

miR-133b在動(dòng)脈粥樣硬化兔血液和血管斑塊組織中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-133b通過(guò)抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖活性和遷移能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。miR-133b表達(dá)下調(diào)可抑制巨噬細(xì)胞的增殖和遷移，同時(shí)促進(jìn)巨噬細(xì)胞的凋亡，從而減弱動(dòng)脈粥樣硬化中易損斑塊的形成和血管重塑[8]。可見(jiàn)在不同細(xì)胞模型中，miR-133b發(fā)揮的功能相互矛盾，而miR-133b在OxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用尚不清楚。本研究顯示OxLDL誘導(dǎo)后血管內(nèi)皮細(xì)胞胞體縮小、皺縮，核膜模糊，較多的細(xì)胞變圓脫落，miR-133b的表達(dá)顯著降低，Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著降低，Bax蛋白的表達(dá)顯著增加，細(xì)胞凋亡率顯著升高。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，可抑制線粒體依賴(lài)的caspase途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)ax則發(fā)揮相反的作用，研究報(bào)道m(xù)iR-133b可減弱MPP+誘導(dǎo)的Bax和Bcl-2表達(dá)改變，改善MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)軸突變性[9，10]。本研究顯示過(guò)表達(dá)miR-133b可改善細(xì)胞形態(tài)，減少皺縮和懸浮細(xì)胞數(shù)量，逆轉(zhuǎn)Bcl-2表達(dá)降低和Bax表達(dá)增加，減輕OxLDL誘導(dǎo)后血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，這與徐瑞等[3]和程潔等[5]報(bào)道的miR-133b保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞和心肌損傷的作用相吻合。進(jìn)一步研究顯示OxLDL誘導(dǎo)后血管內(nèi)皮細(xì)胞中MDA的含量顯著增加，SOD和GSH-Px的活性顯著降低。氧自由基作用于不飽和脂肪酸產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物MDA，MDA含量是反應(yīng)機(jī)體過(guò)氧化程度和間接反應(yīng)細(xì)胞損傷程度的重要指標(biāo)，SOD和GSH-Px是清除氧自由基的抗氧化物質(zhì)，可減輕氧自由基對(duì)細(xì)胞的損傷[11-13]。本研究顯示過(guò)表達(dá)miR-133b后可降低血管內(nèi)皮細(xì)胞MDA的含量，升高SOD和GSH-Px活性。以上結(jié)果提示過(guò)表達(dá)miR-133b可減輕OxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷和凋亡。

SGTB是含肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域(tetratricopeptide repeat，TRP)基序家族成員之一，研究顯示SGTB在肝癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)，與腫瘤的組織學(xué)分級(jí)顯著相關(guān)，SGTB表達(dá)降低是肝癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)[14]。miR-365b通過(guò)下調(diào)SGTB促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲[15]。此外，SGTB高表達(dá)參與脂多糖誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡[16]。但目前尚無(wú)SGTB在心血管疾病中的相關(guān)研究。本研究顯示OxLDL誘導(dǎo)后血管內(nèi)皮細(xì)胞中SGTB的表達(dá)顯著升高，干擾SGTB表達(dá)可抑制OxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷、凋亡和形態(tài)學(xué)改變，并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和Western blot證實(shí)miR-133b靶向負(fù)性調(diào)控SGTB表達(dá)。進(jìn)一步研究顯示過(guò)表達(dá)SGTB可逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-133b對(duì)OxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激水平的影響。以上結(jié)果提示miR-133b通過(guò)抑制SGTB表達(dá)對(duì)OxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

綜上所述，在OxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞miR-133b表達(dá)下調(diào)，SGTB表達(dá)上調(diào)。過(guò)表達(dá)miR-133b通過(guò)靶向SGTB抑制OxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷和凋亡，為防治動(dòng)脈粥樣硬化血管損傷提供了新的方向。