李學(xué)震，鄭明珠，馬艷蕊，和法濤*，劉光鵬

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長(zhǎng)春 130118；2.中華全國(guó)供銷(xiāo)合作總社濟(jì)南果品研究院，山東濟(jì)南 250220）

瓦尼桑黃（Sanghuangprous vaninii）是桑黃菌的一種，由于其跟桑樹(shù)桑黃（Sanghuangprous sanghung）物種親緣關(guān)系很近，所以具有抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等活性功能[1]。研究表明，桑樹(shù)桑黃只生長(zhǎng)在桑樹(shù)的活木上，自然生長(zhǎng)條件局限，人工栽培困難[2]。而瓦尼桑黃菌生長(zhǎng)條件容易控制，可以進(jìn)行人工代料栽培，因此近年來(lái)被廣泛種植[3]。桑黃主要功能成分有多糖、多酚、黃酮和三萜等[4]，其中多酚化合物是桑黃菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物之一，桑黃子實(shí)體和菌絲體中均含有多酚類(lèi)物質(zhì)[5]。桑黃素是桑黃菌中的多酚類(lèi)物質(zhì)之一，可以抑制香蕉中水溶性多糖的降解，從而延緩香蕉在貯藏過(guò)程中的軟化和變質(zhì)[6]。雖然，楊樹(shù)桑黃可以進(jìn)行人工栽培，但是生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、需要不斷調(diào)整每個(gè)生長(zhǎng)階段的生長(zhǎng)條件。桑黃菌液態(tài)發(fā)酵可以大量生產(chǎn)桑黃菌菌絲體，菌絲體中含有大量的多酚類(lèi)物質(zhì)，且接種量少，發(fā)酵周期短，只需要5～7 d[7]。

有研究表明，在培養(yǎng)基中加入真菌激發(fā)子[8]、脂類(lèi)物質(zhì)[9]、桑樹(shù)產(chǎn)物[10-11]和稀土元素[12]等，可以有效提高桑黃菌液態(tài)發(fā)酵中黃酮、多糖和三萜等目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。Ma 等[13]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中分別添加0.03 g/L 萘乙酸和0.02 g/L 豆香素，可以明顯提高桑黃菌液態(tài)發(fā)酵中的黃酮產(chǎn)量，但以不同糧食作為桑黃菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)選用5 種不同糧食作物作為液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，4 種動(dòng)植物氮源和兩種桑產(chǎn)物，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化了桑黃菌液態(tài)發(fā)酵的生產(chǎn)工藝，為桑黃菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)多酚類(lèi)物質(zhì)及產(chǎn)品利用與開(kāi)發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

桑黃菌菌株，由山東省臨清市哲碩農(nóng)產(chǎn)品有限公司提供，經(jīng)山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院鑒定為瓦尼桑黃菌（Sanghuangporus vaninii）。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基，購(gòu)自青島賓得生物技術(shù)有限公司。PDB培養(yǎng)基，購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.75 g，氯化鈣0.75 g，蒸餾水1 L。

1.1.3 試劑

葡萄糖、無(wú)水氯化鈣、無(wú)水碳酸鈉，天津大茂化學(xué)試劑廠；磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；福林酚試劑，上海麥克林生化科技有限公司；無(wú)水乙醇，天津富宇精細(xì)化工有限公司，以上試劑均為分析純。酵母粉，賽默飛世爾科技公司；牛肉膏，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；桑葉、桑葚由山東省臨清市哲碩農(nóng)產(chǎn)品有限公司提供；小米、玉米、高粱、蕎麥、豆粕、麩皮均為市售。

1.1.4 儀器與設(shè)備

BSC-150 恒溫培養(yǎng)箱、YXQ-LS-100A 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；手持?jǐn)嚢杵?，揚(yáng)州均瑞機(jī)械設(shè)備有限公司；無(wú)菌操作臺(tái)，深圳藍(lán)思凈化科技有限公司；打孔器，廣州科友生物科技有限公司；UV-1000 型紫外分光光度儀，上海天美科學(xué)儀器有限公司；TDL-5A 低速大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器有限公司；ME-104 型萬(wàn)分之一天平，梅特勒托利多儀器有限公司；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；R308 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司；ZWYR-2112B 型恒溫調(diào)速搖床柜，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；FD-2 型真空冷凍干燥機(jī)，上海比朗儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種平板活化與制備

取實(shí)驗(yàn)室中已分離純化后的桑黃菌菌株斜面，在無(wú)菌操作臺(tái)上取0.5 cm2接入PDA 平板，菌株長(zhǎng)到4～6 cm時(shí)，保存于4 ℃冰箱中備用，使用前在28 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)6 h。

1.2.2 發(fā)酵種子液制備

取平板上的菌絲，用直徑5 mm 的打孔器打孔，接入PDB 培養(yǎng)基，裝液量每瓶100 mL/250 mL，每瓶接種4塊。28 ℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)7 d，待菌種長(zhǎng)滿(mǎn)搖瓶，用手持?jǐn)嚢杵髟跓o(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)將菌絲打散，但不破壞細(xì)胞，放入4 ℃冰箱備用，使用前在搖床28 ℃恒溫培養(yǎng)6 h。

液體發(fā)酵培養(yǎng)：將制備的種子液，接入配置好的培養(yǎng)基中，接種量10%，裝液量200 mL/500 mL，每個(gè)菌種3瓶。28 ℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)7 d。

1.2.3 桑黃菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源篩選

選擇5 種糧食作物為碳源小米粉、玉米粉、薏米粉、蕎麥粉、高粱粉，添加量均為2%，分別加入基本培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件：26 ℃，裝液量200 mL，搖瓶轉(zhuǎn)速150 r/min，500 mL 搖瓶培養(yǎng)7 d，抽濾得菌絲體，凍干后測(cè)多酚含量和菌絲生物量。

1.2.4 桑黃菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基氮源篩選

選擇4 種常見(jiàn)的氮源：豆粕粉、麩皮粉、酵母粉、牛肉膏，添加量均為1%，分別加入基本培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同1.2.3，抽濾得菌絲體，凍干后測(cè)量多酚含量和菌絲生物量。

1.2.5 桑黃菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基生長(zhǎng)因子篩選

選用兩種生長(zhǎng)因子：桑葉粉和桑葚粉，添加量均為1%，分別添加到基本培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件同1.2.3，抽濾得菌絲體，凍干后測(cè)多酚含量和菌絲生物量。

1.2.6 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果配制培養(yǎng)基，將制備好的瓦尼桑黃菌種子按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的接種量進(jìn)行接種。PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)包括8 個(gè)因素，即小米粉、酵母粉、桑葉粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2、pH 和接種量；以上8 個(gè)因素各設(shè)置高水平（+1）和低水平（-1），實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)的因素和水平編碼值Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

1.2.7 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert 10.0 軟件對(duì)具有顯著性的因素包括小米粉、磷酸二氫鉀、接種量進(jìn)行中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，并以桑黃菌菌絲總多酚得率為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，共20 個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，詳見(jiàn)表2。

表2 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 2 Factors and levels of central composite design

1.2.8 桑黃菌菌絲生物量及總多酚含量測(cè)定

將發(fā)酵培養(yǎng)液抽濾得菌絲體，將菌絲體取出用蒸餾水清洗3 次，再抽濾后，在-40 ℃條件下預(yù)冷凍24 h，冷肼溫度-80 ℃，真空度10 Pa 條件下凍干12 h，稱(chēng)重法測(cè)菌絲生物量。桑黃菌絲總多酚得率按照冉軍艦等[14]的方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與測(cè)定。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.0 進(jìn)行繪圖，SPSS Statistics 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，Design-Expert 10.0 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總多酚含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用福林酚法，在765 nm 處測(cè)定吸光度，總多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=1.320 8x＋0.000 6，R2=0.998 5，線性范圍為10～160 μg/mL。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基碳源的篩選結(jié)果

不同植物碳源加入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，以桑黃菌菌絲生物量和多酚含量為指標(biāo)進(jìn)行篩選[15]。由圖1 可以看出，以小米粉為碳源發(fā)酵桑黃菌的菌絲生物量和多酚含量均最高，分別為2.21 g 和2.05 mg/g。玉米粉發(fā)酵的桑黃菌絲體多酚含量1.82 mg/g，菌絲生物量為1.12 g。高粱粉發(fā)酵桑黃菌菌絲生物量和多酚含量均最低，分別為0.35 g和1.06 mg/g。蕎麥粉發(fā)酵桑黃菌菌絲體生物量為0.59 g，與薏米粉發(fā)酵桑黃菌相差3 倍左右，但菌絲多酚含量高于薏米粉發(fā)酵桑黃菌，為1.23 mg/g；薏米粉發(fā)酵的桑黃菌菌絲生物量和多酚含量分別為1.68 g 和1.12 mg/g。綜上，小米粉發(fā)酵的桑黃菌兩指標(biāo)均最佳，因此選擇小米粉為液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基碳源。

圖1 不同植物碳源對(duì)桑黃菌發(fā)酵的影響Fig.1 Effects of different plant carbon sources on the fermentation of Sanghuangprous

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基氮源篩選結(jié)果

圖2 顯示了不同氮源對(duì)桑黃菌發(fā)酵的影響。由圖知，以豆粕粉為氮源發(fā)酵的桑黃菌菌絲生物量和多酚含量分別為1.66 g 和1.52 mg/g，低于酵母發(fā)酵桑黃菌的菌絲生物量（2.01 g）和菌絲多酚含量（2.48 mg/g）；同為植物氮源，以麥麩為氮源發(fā)酵的菌絲生物量只有0.77 g，多酚含量?jī)H1.13 mg/g；牛肉膏發(fā)酵得到的菌絲生物量最低，為0.57 g，但多酚含量高于麥麩，為1.31 mg/g。綜上，選擇酵母粉作為氮源進(jìn)行桑黃菌液態(tài)發(fā)酵較適宜。

圖2 不同氮源對(duì)桑黃菌發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources on fermentation of Sanghuangprous

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基生長(zhǎng)因子篩選

有研究表明，桑樹(shù)枝水提物能增加桑黃菌液態(tài)發(fā)酵的菌絲生物量，及發(fā)酵液中有效成分的含量[10]。本實(shí)驗(yàn)采用桑葉和桑葚作為生長(zhǎng)因子，考察其對(duì)桑黃菌液態(tài)發(fā)酵菌絲生物量和多酚含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖可知，添加1%桑葉粉后，桑黃菌液態(tài)發(fā)酵菌絲生物量為1.34 g，菌絲多酚含量為1.85 mg/g，明顯高于添加1%桑葚粉發(fā)酵的菌絲生物量（1.14 g）和多酚含量（1.22 mg/g）。因此，選用桑葉粉作為液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的生長(zhǎng)因子。

圖3 不同生長(zhǎng)因子對(duì)桑黃菌發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of different growth factors on the fermentation of Sanghuangprous

2.5 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及方差分析

根據(jù)文獻(xiàn)，除本實(shí)驗(yàn)篩選的碳源、氮源及生長(zhǎng)因子外，微量元素、pH 值和接種量也對(duì)菌絲多酚含量產(chǎn)生影響。因此，對(duì)影響桑黃菌菌絲多酚含量的8 個(gè)因素，即小米粉（X1）、酵母粉（X2）、桑葉粉（X3）、MgSO4·7H2O（X4）、KH2PO4（X5）、CaCl2（X6）、pH（X7）、接種量（X8）進(jìn)行了研究。結(jié)果如表4 所示，當(dāng)X2和X5處于低水平，X1、X3、X4、X6、X7、X8處于高水平時(shí)，桑黃菌絲多酚含量達(dá)到了2.51 mg/g；當(dāng)X3、X7、X8處于低水平，X1、X2、X4、X5、X6，桑黃菌絲多酚含量?jī)H有0.32 mg/g。

表4 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 4 Results of Plackett-Burman experimental design

通過(guò)Design-Expert 10.0 軟件對(duì)Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，在所進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的8 個(gè)因素中，有3個(gè)因素對(duì)結(jié)果影響顯著，分別是小米粉、KH2PO4和接種量。根據(jù)擬合方程：Y=+1.63-0.19X1-0.16X2+0.18X3-0.06X4-0.32X5-0.09X6+0.16X7+0.28X8可知，R-Sq(adj）=87.77%，說(shuō)明方程擬合度良好。由表5 可知，在影響試驗(yàn)結(jié)果最顯著的3 個(gè)因素中，X8對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響最大，X5次之，X1最小，其中X1和X5系數(shù)為負(fù)值，說(shuō)明呈現(xiàn)負(fù)效應(yīng)，X8系數(shù)為正值，說(shuō)明呈現(xiàn)正效應(yīng)。

表5 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)方差分析Table 5 Variance analysis of Plackett-Burman

2.6 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及方差分析

采用中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以多酚類(lèi)化合物為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)培養(yǎng)基中小米粉、KH2PO4加量和接種量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表6。利用Design-Expert 10.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到桑黃菌菌絲體中多酚含量（Y）與小米粉（A）、KH2PO4（B）、接 種 量（C）之 間 的 回 歸 方 程：Y=2.53+0.21A+0.31B+0.21C+0.19AB+0.22AC+0.10BC-0.29A2-0.51B2-0.31C2。

表6 中心組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Result of central combination design

回歸分析表明（見(jiàn)表7），模型P＜0.000 1，說(shuō)明回歸方程差異極顯著，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠，同時(shí)失擬項(xiàng)P=0.077 9＞0.05 不顯著，表明此模型與實(shí)際值的吻合度高，模型精確。R2=0.937 4，即約93.74%桑黃菌菌絲多酚變化可由上述模型解釋?zhuān)f(shuō)明該模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間的相關(guān)度較好。模型中1 次項(xiàng)A、B、C 對(duì)桑黃菌菌絲多酚影響顯著，交互項(xiàng)AB、AC，二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)多酚含量影響顯著，顯著性次序?yàn)锽＞A＞C。

表7 中心組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 7 Variance analysis of central combination design

2.7 響應(yīng)面分析

圖4 是通過(guò)Design-Expert 10.0 軟件處理得出的結(jié)果，對(duì)培養(yǎng)基中小米粉、KH2PO4和接種量3 個(gè)因素的兩兩交互作用進(jìn)行分析。當(dāng)接種量一定時(shí)，菌絲總多酚含量隨著KH2PO4和小米粉添加量的增加先增后減。KH2PO4等高線圖的變化密集，小米粉的等高線變化較稀疏，即KH2PO4對(duì)菌絲多酚含量的影響比小米粉顯著（圖4a）。當(dāng)KH2PO4一定時(shí)，桑黃菌菌絲多酚含量隨接種量的增加而增加，隨小米粉含量的增加先增大后減少，且兩者有較強(qiáng)的交互作用，相對(duì)于小米粉等高線比接種量的密集，即接種量比小米粉對(duì)菌絲多酚影響顯著（圖4b）。當(dāng)小米粉含量一定時(shí)，多酚含量隨接種量的增加而增加，隨KH2PO4含量先增加后減少，兩者沒(méi)有顯著的交互作用，相對(duì)接種量而言，等高線向KH2PO4變化較密集，因此KH2PO4對(duì)菌絲多酚含量影響較接種量顯著（圖4c）。

圖4 響應(yīng)面等高線圖Fig.4 Contour map of response surface

綜上所述，根據(jù)模型預(yù)測(cè)的最佳發(fā)酵方案為小米粉24.00 g/L、酵母粉10 g/L、桑葉粉10 g/L、KH2PO41.08 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、CaCl21 g/L、pH 6.5、接種量11.64%，在此條件下發(fā)酵的桑黃菌菌絲體總多酚含量預(yù)測(cè)值為2.62 mg/g。

2.8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)上述培養(yǎng)基配方進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)理論值與實(shí)際結(jié)果是否一致。在三次平行試驗(yàn)后，測(cè)得桑黃菌發(fā)酵菌絲多酚含量為2.63 mg/g，相對(duì)誤差在±0.5%以?xún)?nèi)，且有較好的重復(fù)性，表明培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果正確可靠。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)在三組單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，篩選出適用于桑黃菌液態(tài)發(fā)酵的碳源、氮源和生長(zhǎng)因子，結(jié)果表明：小米、酵母粉和桑葉粉對(duì)桑黃菌液態(tài)發(fā)酵高產(chǎn)菌絲體和總多酚均有顯著影響。通過(guò)PB 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析，優(yōu)化了桑黃菌液態(tài)發(fā)酵多酚高產(chǎn)的發(fā)酵工藝條件，即小米粉24.00 g/L、酵母粉10 g/L、桑葉粉10 g/L、KH2PO41.08 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、CaCl21 g/L、pH 6.5、接種量11.64%，在此條件下發(fā)酵桑黃菌菌絲總多酚含量為2.62 mg/g。在驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，桑黃菌菌絲總多酚含量為2.63 mg/g，相對(duì)誤差較小，實(shí)驗(yàn)效果穩(wěn)定，可以為以液態(tài)發(fā)酵法大量生產(chǎn)桑黃菌絲多酚提供理論支持。