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        莖用萵苣褪綠心腐病調(diào)查研究

        2021-12-08 08:39:06胡啟鑌劉建密陳文樂陳彩霞黃培枝林積秀
        中國果菜 2021年11期
        關(guān)鍵詞:綠心葉蟬原體

        胡啟鑌,劉建密*,陳文樂,陳彩霞,黃培枝,林積秀

        (1.福建三明市植保植檢站,福建三明 365000;2.福建永安市植保植檢站,福建永安 366000)

        莖用萵苣是福建省春、秋兩季的主要經(jīng)濟(jì)作物,‘飛橋萵苣’作為主栽品種,具有地方特色,并獲“國家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品”稱號。因其質(zhì)地爽脆,味道鮮甜、風(fēng)味獨(dú)特,深受消費(fèi)者歡迎,以‘飛橋萵苣’為主要品種的莖用萵苣種植已成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收的支柱產(chǎn)業(yè)之一。

        2005 年在‘飛橋萵苣’原產(chǎn)區(qū)永安等地首次出現(xiàn)一種萵苣新病害,帶病移栽后造成萵苣死苗、缺株,后期感染造成頂部葉片褪綠、生長停滯、莖部變褐、不堪食用等;罹病株喪失經(jīng)濟(jì)價值。2008 年,該病在莖用萵苣種植區(qū)爆發(fā)為害,平均株發(fā)病率達(dá)20.5%,嚴(yán)重的地塊株發(fā)病率高達(dá)53.6%。2012 年明確了該病是一種植原體病害,并將之命名為“莖用萵苣褪綠心腐病”(lettuse chlorotic leaf rot disease,LCLRD)。該病的發(fā)生嚴(yán)重影響了莖用萵苣的產(chǎn)量、質(zhì)量和效益。因此,在‘飛橋萵苣’主栽區(qū)永安市調(diào)查了該病害的病原、傳播介體、寄主種類、病害發(fā)病規(guī)律及防控技術(shù)等,總結(jié)了一套科學(xué)有效的莖用萵苣褪綠心腐病綜合防控技術(shù),以推廣應(yīng)用。

        1 試驗方法

        1.1 病原鑒定方法

        1.1.1 病因排查

        為明確病因,在萵苣生產(chǎn)季開展了大量田間病因篩查試驗。田間試驗均設(shè)空白對照,按照正常生產(chǎn)栽培。缺素試驗中各處理撒施或噴施不同元素(鈣肥、硼肥、錳肥、鋅肥等)種類的肥料;藥劑試驗中不同處理噴施不同類型藥劑(治療細(xì)菌、抑制真菌、抗病毒劑、殺蟲劑、殺螨劑等藥劑)或全程覆蓋防蟲網(wǎng);抗生素試驗各處理采用不同類型抗生素(青霉素、土霉素)灌根的方法;不同類型的試驗均設(shè)3 次重復(fù),隨機(jī)排列,依次分年度開展。

        室內(nèi)試驗采用常規(guī)病原菌分離培養(yǎng)方法,室內(nèi)或保濕培養(yǎng)或直接用培養(yǎng)基培養(yǎng),并用普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。根據(jù)病毒病的傳播特點(diǎn),開展傳統(tǒng)的摩擦接毒試驗。

        1.1.2 病原鑒定

        采用DAPI 熒光顯微鏡檢測。取新鮮萵苣切100~200 μm 厚度的薄片,用戊二醛固定,DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚鹽酸)染色,最后用Leica DM6000B 落射熒光顯微鏡檢查韌皮部篩管內(nèi)植原體特異性熒光的有無和強(qiáng)弱,紫外線激發(fā)濾光片波長為365 nm,阻斷濾光片波長為420 nm。

        用PCR 法擴(kuò)增。使用植原體16S rDNA 基因序列通用引物R16mF2(5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′)和R16mR2(5′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′),對病株及健康株分別提取總DNA,以提取的植物總DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

        采用電子顯微鏡觀察。取染病根和葉脈組織進(jìn)行固定和超薄切片,通過透射電子顯微鏡觀察植物韌皮部篩管中的植原體細(xì)胞形態(tài),發(fā)現(xiàn)其形狀呈球狀、橢圓形或不規(guī)則形且大小在60~1 100 nm 范圍的無細(xì)胞壁菌體。另在植物維管束組織中找到成熟的篩管,在篩管內(nèi)觀察到符合的菌體形態(tài),則判斷為植原體的把握性就很大。

        1.2 傳播介體鑒定方法

        利用植原體16S rDNA 基因的PCR 擴(kuò)增通用引物R16mF2/R16mR2 和R16F2n/R16R2,對昆蟲樣本總DNA進(jìn)行巢式PCR 鑒定,檢測各種葉蟬在自然條件下攜帶莖用萵苣褪綠心腐植原體的情況。

        葉蟬回接試驗,萵苣生產(chǎn)季采用田間捕捉葉蟬活蟲,全部放入含有盆栽萵苣褪綠心腐病株的養(yǎng)蟲籠中,飼菌3 d 后將葉蟬從中挑選歸類后分別放入盆栽健株的養(yǎng)蟲籠中飼養(yǎng),每個養(yǎng)蟲籠放置2~3 株經(jīng)防蟲網(wǎng)育苗的萵苣健株,每個養(yǎng)蟲籠放置同種類的昆蟲1~5 頭,觀察健株是否發(fā)病,30 d 后利用植原體16S rDNA 基因的PCR 擴(kuò)增通用引物R16mF2/R16mR2 和R16F2n/R16R2,對萵苣樣本總DNA 進(jìn)行巢式PCR 鑒定。

        1.3 寄主植物鑒定方法

        在永安當(dāng)?shù)夭煌竟?jié)采集萵苣田間雜草及萵苣田周圍有疑似叢枝、簇芽、小葉、黃化等癥狀的農(nóng)作物和林木,利用植原體16S rDNA 基因的PCR 擴(kuò)增通用引物R16mF2/R16mR2 和R16F2n/R16R2,對各植物樣本總DNA 進(jìn)行巢式PCR 鑒定,檢測各種植物帶菌情況。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 病原

        2.1.1 田間癥狀

        苗期無癥狀或癥狀不明顯,帶病植株移栽后至蓮座期,先是在心葉顯癥,心葉出現(xiàn)褪綠或褪紅,葉色變淡變白,隨后頂部葉片挺直變細(xì),嫩葉基部流膠,而后停止生長,最后心腐死株。旺長抽莖后,罹病植株頂部葉片褪綠或褪紅變白、生長停滯。剖開莖部,早期感染部位變褐或干枯,近根莖部外層變褐;后期感染莖中髓失水成空心狀,近根莖部略有變褐[1-2]。

        2.1.2 病因排查分析

        多年病因篩查試驗結(jié)果已由項目組林積秀等[1-2]發(fā)表,根據(jù)多年的試驗結(jié)果,分析得出:首先排除了缺鈣、硼、錳等缺素原因;運(yùn)用傳統(tǒng)的摩擦接毒試驗,健康植株未發(fā)病,田間藥劑試驗用抗病毒病藥劑處理對該病害無緩解效果,初判非病毒引起;室內(nèi)試驗未能分離出細(xì)菌、真菌,將病部高濕培養(yǎng),肉眼和顯微鏡均未發(fā)現(xiàn)有噴菌現(xiàn)象或菌絲體,同時各類型藥劑試驗表明,細(xì)菌性、真菌性藥劑處理也沒有使病害變輕,初判非細(xì)菌、真菌引起;田間調(diào)查發(fā)現(xiàn),在萵苣地上部和地下部均未見明顯的咀嚼式口器昆蟲留下的蟲口傷,田間病因篩查試驗中覆蓋防蟲網(wǎng)和噴施殺蟲劑兩個處理可以緩解或減少病害的發(fā)生,苗期覆蓋防蟲網(wǎng)大田期噴施殺蟲劑的復(fù)合處理有明顯的防控效果,試驗確認(rèn)了萵苣褪綠心腐病的發(fā)生為害與某種或某些種昆蟲蟲量的多少密切相關(guān),防蟲治蟲可以有效地減輕該病的發(fā)生。同時選用土霉素和青霉素兩種抗生素對病株進(jìn)行灌根試驗,發(fā)現(xiàn)用土霉素灌根處理后,病株癥狀發(fā)展得到有效抑制,新發(fā)枝葉逐漸恢復(fù)正常,而青霉素處理則無效,病株持續(xù)發(fā)展,直至整株死亡,由于青霉素作用部位為細(xì)胞壁,而土霉素作用部位為細(xì)胞膜,結(jié)合防蟲治蟲可減緩病害發(fā)生,推測該病應(yīng)為刺吸式口器昆蟲傳播且由只有細(xì)胞膜而無細(xì)胞壁的植原體引起[3-5]。

        2.1.3 病原鑒定

        用DAPI 熒光顯微鏡檢測得出(圖1),在病株主莖和葉中肋橫切片的外生韌皮部區(qū)域和內(nèi)生韌皮部區(qū)域都存在亮藍(lán)色的植原體DNA 被染色后發(fā)出的強(qiáng)熒光斑;從主莖和葉中肋的縱切片中可以看到長條狀、充滿植原體DNA 藍(lán)熒光的篩管細(xì)胞,或單一篩管存在植原體熒光,或多條篩管同時充滿熒光,而健康植株中未見植原體特異性熒光。

        圖1 萵苣植原體DAPI 熒光顯微鏡觀察結(jié)果Fig.1 DAPI fluorescence microscopy observations of symptomed lettuce plant

        經(jīng)PCR 檢測,從病株中檢測得到大約1.4 kb 的DNA片段,經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫中BLAST 分析,為翠菊黃化組(16Sr Ⅰ)成員,進(jìn)一步系統(tǒng)進(jìn)化樹分析得出該組歸屬于16SrⅠ-B 亞組植原體,同時又用電子顯微鏡觀察了莖用萵苣褪綠心腐病植原體的微觀形態(tài)。在感病萵苣的葉脈和根的組織篩管細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了圓形或不規(guī)則形狀的植原體存在,大小在200~800 nm 之間[6-7]。

        2.2 傳播介體

        試驗共檢測了12 種葉蟬和1 種蝽象,共計116 個樣本,其中葉蟬7 號(未定屬種)、黑額二叉葉蟬、褐室二斑葉蟬和黃綠二室葉蟬4 種葉蟬的14 個樣本中攜帶植原體。如圖2 電泳圖譜所示,黑額二叉葉蟬、褐室二斑葉蟬和黃綠二室葉蟬的4~6 泳道與3 泳道的正對照均在1 200 bp 左右的位置顯示明亮的目的條帶,初判斷葉蟬7號、黑額二叉葉蟬、褐室二斑葉蟬和黃綠二室葉蟬這4 種葉蟬為萵苣褪綠心腐病的潛在傳播媒介。

        圖2 部分葉蟬帶菌情況巢式PCR 電泳圖譜Fig.2 Nested PCR electrophoresis map of some leafhopper

        飼菌回接試驗于2013—2016 年持續(xù)了做了3 個萵苣生產(chǎn)年度,共做了75 批次14 種昆蟲(包括葉蟬7 號、黑額二叉葉蟬、褐室二斑葉蟬和黃綠二室葉蟬等10 種葉蟬,白背飛虱、褐飛虱和2 種蝽象)的回接試驗,結(jié)果顯示:有2 次回接黑額二叉葉蟬的健株在回接后表現(xiàn)褪綠心腐癥狀,并檢測到了萵苣褪綠心腐病植原體;在黑額二叉葉蟬回接的3 次未顯癥萵苣上也檢測到萵苣褪綠心腐病植原體,從而確定了黑額二叉葉蟬為萵苣褪綠心腐病的媒介昆蟲[7]。

        2.3 寄主植物

        試驗共采集了21 科61 種植物共計518 株樣本,其中農(nóng)作物種類有16 種,分別是油麥菜、萵苣、辣椒、白蘿卜、生菜、包菜、茼蒿菜、馬鈴薯、玉米、花生、甘薯、煙草、茄子、薏仁、空心菜和西紅柿;林木種類有4 種,分別是苦楝、竹柏、梧桐和竹子;雜草種類有41 種。

        經(jīng)巢式PCR 檢測(如圖3 所示),泳道1 萵苣病株為正對照,泳道2~11 為其他植物,顯示與正對照有相同大小的目的條帶,即在辣椒、苦楝、油麥菜、生菜等中檢測到植原體的存在。同時在永安開展調(diào)查時,發(fā)現(xiàn)黃椒、紅椒、雞爪椒和長椒上檢測出植原體,而朝天椒和牛角椒未檢測出植原體,從而明確了辣椒、苦楝、油麥菜、生菜為莖用萵苣褪綠心腐病的中間寄主植物[7-9]。

        圖3 部分寄主植物的巢式PCR 電泳圖片F(xiàn)ig.3 The nested PCR electrophoresis map of some of the host plants

        3 發(fā)病規(guī)律

        莖用萵苣播種早,葉蟬密度高發(fā)病重;氣溫高,遇天氣干旱,利于葉蟬活動繁殖和植原體增殖,發(fā)病重;管理粗放,雜草多,發(fā)病重;連作田發(fā)病重。黑額二叉葉蟬蟲量大的田塊辣椒叢枝病(植原體病害)發(fā)病重,前作田為辣椒的田塊莖用萵苣褪綠心腐病發(fā)病重。經(jīng)蟲情測報燈下觀察,黑額二叉葉蟬發(fā)生與秋萵苣生長期高度吻合,9—10 月為燈下高峰期。該葉蟬體型小,雄蟲2.6~2.7 mm,雌蟲2.7~2.8 mm,田間多在葉背面或雜草中棲息,活動方式多為跳躍飛行,活動范圍較??;驚擾后易跳躍,不易近距離觀察,田間未見卵少見若蟲,成蟲對黃板有趨性。

        該病的初侵染源主要是中間寄主辣椒、苦楝、油麥菜和生菜,在萵苣生長季(9 月至翌年4 月)通過黑額二叉葉蟬刺吸傳病,或本身帶毒的黑額二叉葉蟬直接為害傳?。辉摬〉脑偾秩局饕揽棵浇槔ハx黑額二叉葉蟬在田間短距離傳播;病原物需要在活體萵苣或中間寄主體內(nèi)越冬,也可在越冬的黑額二叉葉蟬體內(nèi)存活,來年氣候條件適宜,繼續(xù)傳播為害;春萵苣生產(chǎn)季結(jié)束后,黑額二叉葉蟬在中間寄主、雜草或其他植物上繼續(xù)繁殖生存,轉(zhuǎn)主為害辣椒等中間寄主,9 月份繼續(xù)為害秋萵苣[10]。

        4 綜合防控技術(shù)及成效

        4.1 綜合防控技術(shù)

        根據(jù)莖用萵苣褪綠心腐病是植原體病害這一特征,在生產(chǎn)上宜采用“農(nóng)業(yè)防治、治蟲防病”的防治策略[10-12],即協(xié)調(diào)應(yīng)用農(nóng)業(yè)、物理、生物、化學(xué)防治措施,開展生態(tài)調(diào)控,阻斷或減少蟲媒與作物的接觸傳病,控制田間蟲媒種群數(shù)量,防范莖用萵苣褪綠心腐病爆發(fā)成災(zāi)。

        4.1.1 農(nóng)業(yè)防治

        (1)適時播種

        在三明高海拔地區(qū)(海拔500 m 以上),莖用萵苣播種期宜安排在9 月初,中低海拔地區(qū)(海拔500 m 以下),莖用萵苣播種期宜安排在9 月20 日左右。其他市、縣可按相應(yīng)氣象狀況調(diào)整播種期,遠(yuǎn)離辣椒、苦楝樹、油麥菜和生菜等其他寄主生長地育苗,減少侵染為害。

        (2)施足基肥

        種植田要重施基肥,掌握在移栽前3~5 d,每667 m2施腐熟有機(jī)肥2 500 kg、鈣鎂磷肥100 kg 和45%三元復(fù)合肥50 kg,然后翻耕整畦。

        (3)田間生態(tài)調(diào)控措施

        一般在播種后18 d 左右,萵苣苗4~5 葉時打孔移栽。移苗帶土,宜在陰天或傍晚移栽定植,定植后澆透定根水。移栽后至團(tuán)棵期土壤要保持濕潤,采用早晚噴淋澆水,澆透水,使田間一直保持高濕狀態(tài),創(chuàng)造有利于幼苗扎根成活、不利于葉蟬生長的環(huán)境,控制葉蟬種群的突增。幼苗成活后,結(jié)合灌水每667 m2每次追施5 kg 尿素和5 kg 硫酸鉀,隔5~7 d 澆施一次,促其早生快發(fā),縮短易受害感病期。肉質(zhì)莖形成期要求水分充足,缺水莖棒小,莖基部表皮易開裂,團(tuán)棵期后忌潑澆,以溝灌為主,保持畦面干爽。蓮座期葉面噴施0.3%硼砂液一次。萵苣現(xiàn)蕾前或心葉與外葉齊平時及時采收。

        (4)及時拔除病株補(bǔ)植健株

        拔苗移栽時,要剔除已表現(xiàn)出輕微癥狀的感病株,做到少帶病苗進(jìn)大田。同時在移栽時要多預(yù)留一些假植苗備用。大田期要經(jīng)常巡查,發(fā)現(xiàn)病株須及時拔除,并從假植苗中取健株補(bǔ)栽。拔除的病株不能隨意丟棄,必須集中堆漚。

        4.1.2 物理防治

        (1)防蟲網(wǎng)覆蓋培育壯苗

        播種后用30 目防蟲網(wǎng)覆蓋,網(wǎng)上加蓋黑色遮陽網(wǎng)。覆蓋形式為將竹片彎成小拱插于大田畦溝,拱架上覆蓋防蟲網(wǎng),網(wǎng)底邊用土塊壓實(shí),成小拱棚。要避免苗長高后葉片緊貼防蟲網(wǎng)給葉蟬攝食傳病有可乘之機(jī)。稀播育壯苗,每10 m2播5 g 種子。萵苣出苗后去掉遮陽網(wǎng)。萵苣苗期施水、肥可直接從防蟲網(wǎng)上方施入,不能掀網(wǎng)。

        萵苣苗移栽前2~3 d 揭開防蟲網(wǎng)煉苗時,要隨即噴施吡蚜酮+高效氯氰菊酯等農(nóng)藥防范葉蟬為害,同時做到帶藥移栽。

        (2)大田期黃板誘殺

        萵苣移栽大田后,應(yīng)立即懸掛黃板。每667 m2均勻懸掛25 cm×30 cm 的黃板30 片左右,黃板下端高出萵苣植株10~15 cm 為宜,并隨植株的生長及時調(diào)整黃板的懸掛高度。

        4.1.3 化學(xué)防治

        (1)苗期噴藥防治蟲媒

        苗期未采用防蟲網(wǎng)覆蓋育苗的,在第二片真葉展開時,選用吡蚜酮或噻蟲嗪加上高效氯氰菊酯,按照包裝說明的用量兌水噴霧,防止葉蟬及其它害蟲為害傳?。? d后再噴一次;移栽前2~3 d 時再噴一次藥,帶入大田,防范剛移栽就遭受葉蟬的取食傳病。采用防蟲網(wǎng)覆蓋育苗的,需在移栽前2~3 d 揭網(wǎng)煉苗時噴一次上述藥劑,之后帶入大田。

        (2)大田期適時噴藥防治葉蟬

        萵苣移栽7 d 后選用吡蚜酮或噻蟲嗪與醚菊酯或高效氯氰菊酯或聯(lián)苯菊酯,按照包裝說明,兌水噴霧防治,藥后5~7 d 續(xù)噴1 次,藥劑輪換使用,防范大田前期媒介葉蟬取食傳病。

        4.2 經(jīng)濟(jì)、社會和生態(tài)成效

        4.2.1 經(jīng)濟(jì)效益顯著

        2014—2018 年5 年間,項目組在永安、大田、沙縣、建甌、武平等縣(市)建立莖用萵苣褪綠心腐病綜合防控技術(shù)示范片,示范面積為200 hm2。實(shí)驗得出:該病平均株發(fā)病率1.64%、防治效果達(dá)90.5%,平均產(chǎn)量達(dá)3 513.8 kg/667 m2,比對照增產(chǎn)437.7 kg/667 m2,萵苣價格按1.5元/kg 計算,增收656.55 元/667 m2。經(jīng)多年萵苣農(nóng)戶實(shí)際調(diào)查結(jié)合試驗示范,示范區(qū)節(jié)工0.7 d/667 m2,按日工資100 元計算,可節(jié)約工本70 元/667 m2;示范區(qū)減少物化成本15.7 元/667 m2;示范區(qū)減少農(nóng)本85.7 元/667 m2。增收節(jié)支742.25 元/667 m2,項目實(shí)施5 年累計推廣9.1萬hm2,總經(jīng)濟(jì)效益10 億元以上,經(jīng)濟(jì)效益顯著。

        4.2.2 社會、生態(tài)效益顯著

        明確了萵苣褪綠心腐病的發(fā)病原因,并采取了高效的綜合防控措施,有效抑制了萵苣產(chǎn)區(qū)莖用萵苣褪綠心腐病的爆發(fā)為害,增加了經(jīng)濟(jì)效益,因此萵苣種植戶、消費(fèi)者滿意度逐年上升,社會效益明顯,同時也減少了農(nóng)藥殘留,保護(hù)了田間生物的多樣性和農(nóng)田生態(tài)環(huán)境,生態(tài)效益顯著。

        5 展望

        自植原體被發(fā)現(xiàn)以來,植原體病害研究取得了重要進(jìn)展。但由于植原體為韌皮部?;?,不易在培養(yǎng)基上進(jìn)行人工培養(yǎng),因此對植原體的研究依然面臨著許多困難和挑戰(zhàn),這也就限定了病害控制手段的開發(fā)。目前有效的措施包括加強(qiáng)防控、利用寄主植物抗性、清除初侵染源和綜合治理媒介昆蟲切斷傳播途徑等,可以控制植原體病害的發(fā)生和流行[11-12],但針對植原體病原本身的防控研究較滯后。

        就萵苣褪綠心腐病而言,其媒介昆蟲、中間寄主等還有待深入研究。如在萵苣、辣椒等田間發(fā)現(xiàn)了形態(tài)特征有明顯不同的30 余種葉蟬,這些種類中如何分類定名,有待進(jìn)一步研究,其中一種葉蟬優(yōu)勢種群可能為新種。在中間寄主的研究方面,本試驗在分析萵苣褪綠心腐病時,發(fā)現(xiàn)了一些其他作物的植原體病害,如辣椒叢枝病,這種病害易與病毒病混淆;同時在植原體病害本底調(diào)查等方面還有待進(jìn)一步研究。

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